3. Ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của đề tài
2.5.1. Phương pháp nghiên cứu
Thực hiện đề tài, chúng tôi sử dụng phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và nghiên cứu quan sát thực địa [33].
mẫu chùm và lấy mẫu phân tầng [27], [33].
Điều tra tỷ lệ nhiễm Fasciola spp, Eurytrema spp, Cysticercus bovis theo phương pháp nghiên cứu cắt ngang [33].
Thu thập mẫu phân theo phương pháp lấy mẫu nghiên cứu đơn giản.
2.5.1.1. Phương pháp lấy mẫu phân trâu, bò, dê
Phân trâu, bò, dê lấy dùng xét nghiệm phải đảm bảo chính xác đúng con vật để chẩn đoán không bị nhầm lẫn, phân còn tươi, mới, có lý lịch rõ ràng. Ở các địa điểm điều tra, chúng tôi đến tận gia đình nuôi trâu, bò, dê vào sáng sớm để trực tiếp lấy tránh nhầm lẫn với các con khác. Gia đình nuôi nhiều trâu, bò, dê phải đảm bảo chính xác đến từng con.
Riêng với dê, phân ở dạng viên, tất cả lại được nhốt chung một hay nhiều ô chuồng nên lấy phân trên nền chuồng sẽ không đảm bảo được chính xác, vì vậy cần lấy phân trực tiếp bằng cách kích thích vào hậu môn làm cho dê thải phân. Mỗi trâu, bò, dê lấy khoảng 10 – 15 g, cho vào túi nilon sạch.
Bên ngoài mỗi túi nilon đựng mẫu phân ghi chép đầy đủ thông tin về chủ gia súc, địa chỉ, tính biệt, lứa tuổi và khối lượng. Tất cả những thông tin trên lại được ghi chép đầy đủ vào sổ theo dõi. Các mẫu phân sau khi lấy được mang xét nghiệm ngay. Nếu mẫu chưa xét nghiệm được ngay thì cần bảo quản bằng cách cho một vài giọt Formalin 1% để ở nhiệt độ dưới 100C.
2.5.1.2. Thu thập Fasciola spp, Eurytrema spp, Cysticercus bovis theo phương pháp mổ khám không toàn diện của K.I. Skirjabin [32].
2.5.1.3. Định loại Fasciola spp, Eurytrema spp, Cysticercus bovis theo khoá định loại của Phan Thế Việt, Nguyễn Thị Kỳ, Nguyễn Thị Lê (1977) [46]. 2.5.1.4. Xét nghiệm trứng Fasciola spp, Eurytrema spp bằng phương pháp gạn rửa sa lắng phân.
giun sán để phân ly trứng ra khỏi phân.
+ Cách tiến hành: Lấy 5 – 10 g phân (với phân dê khoảng 4 – 8 viên phân) cho vào cốc nhựa có V= 200ml, sau đó đổ nước máy sạch vào cho đến đầy gần cốc, dùng đũa thuỷ tinh khuấy tan phân trong dung dịch nước. Sau đó, dung dịch phân được lọc qua lưới sắt (mắt lưới 0,5 – 1mm), bỏ bã trên lưới, dung dịch qua lọc được để yên khoảng 3 – 5 phút cho lắng cặn. Sau đó đổ từ từ phần nước trong ở phía trên đi, lấy cặn lại rồi thêm nước sạch vào cho tới gần đầy cốc, tiếp tục lắng cặn, lặp đi lặp lại 3 – 5 lần, tới khi nước ở phía trên trong, cặn ở đáy còn ít và sạch. Cuối cùng lấy cặn đổ ra hộp lồng và soi dưới kính hiển vi.
2.5.1.5. Định loại trứng Fasciola spp, Eurytrema spp dựa vào nguồn tài liệu của Trịnh Văn Thịnh (1963) [35], [36].
2.5.1.6. Đánh giá cường độ nhiễm trứng/ 1 g phân bằng phương pháp Mc trong phân bằng phương pháp Mc. master [27].
+ Tiến hành phương pháp: cân 2 g phân cần xét nghiệm, cho vào bình thuỷ tinh có chia vạch sẵn. Cho vào bình 58 ml dung dịch nước muối NaCl bão hoà, lúc này lượng dung dịch trong bình đã dâng tới vạch 60ml. Đưa vào bình 10 – 20 viên bi thuỷ tinh, lắc mạnh, dừng đột ngột, dùng pipet hút và bơm vào hai buồng đếm, sao cho lượng dung dịch tràn đều ra diện tích của hai buồng đếm. Đếm trứng ở cả hai buồng đếm (0,15 ml/1 buồng) dưới kính hiển vi quang học.
+ Số lượng trứng trong 1 g phân được tính theo công thức: a
A= x 200 2
Trong đó: A là số lượng trứng có trong 1 g phân
+ Nhiễm nhẹ: có ≈ 200 - 400 trứng / g phân.
Nhiễm ở mức độ trung bình : có ≈ 500 - 600 trứng / g phân. Nhiễm nặng: có ≈ 800 - 1000 trứng / g phân.
- Đánh giá cường độ nhiễm Fasciola spp, Eurytrema spp qua mổ khám theo trị số Min (nhỏ nhất) và Max (lớn nhất).
+ Min: là số sán ít nhất trên một gia súc mổ khám + Max: là số sán nhiều nhất trên một gia súc mổ khám
2.5.1.7. Tìm ấu trùng Cysticercus bovis bằng phương pháp mổ khám cơ thịt trâu, bò, dê.
2.5.1.8. Thu thập trứng Fasciola spp từ túi mật của gia súc nhiễm sán.
Cách mổ túi mật thu trứng: Cho túi mật vào trong một cốc nhựa, dùng dao hoặc kéo rạch túi mật lấy dịch mật. Thêm nước vào gần đầy cốc rồi gạn rửa sa lắng 2 - 3 lần lấy cặn. Trứng Fasciola spp sẽ có ở trong cặn.
2.5.1.9. Đếm trứng Fasciola spp trong dịch mật bằng phương pháp tự tạo. Phương pháp đếm: Dùng công tơ hút dịch mật đã được gạn rửa sa lắng, nhỏ 1 giọt lên bề mặt một lam kính sạch. Đưa lam kính lên kính hiển vi và đếm số trứng trên mỗi giọt. Sau mỗi giọt đếm, ta lại dùng một công tơ hút sạch khác hút nước máy rội sạch bề mặt lam kính vào một đĩa lồng và tiếp tục nhỏ 1 giọt khác lên soi đếm đến khi đủ số lượng trứng cần thí nghiệm thì dừng.
2.5.1.10. Tìm Adolescaria của Fasciola spp, Eurytrema spp trong một số rau cạn và rau thuỷ sinh thường dùng làm thức ăn sống cho người bằng phương pháp nạo vét bề mặt thân rau, ly tâm cặn và soi dưới kính hiển vi quang học.
người, mẫu cây thuỷ sinh và rau cạn được thu thập tại các địa điểm ở huyện Thanh Miện và Chí Linh sau:
Chọn một xã có sinh cảnh đại diện cho vùng đồng bằng, một xã có sinh cảnh đại diện cho vùng miền núi với các đặc điểm nuôi nhiều trâu, bò, dê theo phương thức chăn thả tự do và bán chăn thả. Có nhiều ao, hồ, đồng ruộng ngập nước, người dân trồng nhiều rau thuỷ sinh và rau cạn.
Mỗi loại rau thủy sinh và rau cạn sau khi xác định thường được người dùng làm dùng làm thức ăn sống ở mỗi địa bàn với khối lượng kiểm tra là 6 kg rau muống nước, 6 kg rau ngổ, 6 kg rau muống trên cạn ở cùng một địa điểm, cùng một thời gian. Địa điểm lấy rau là nơi có nhiều trâu, bò, dê qua lại, bến tắm của gia súc, những ruộng rau được bón bằng phân trâu, bò, dê. Lấy rau cách bờ ao, bờ ruộng từ 0,5 – 1 m. Các loại rau được kiểm tra tìm
Adolescaria của Fasciola spp, Eurytrema spp.
2.5.1.11. Thử sức sống của trứng Fasciola spp trong bể biogas bằng cách ngâm trứng vào ngăn sinh khí của bể và nuôi lại trứng trong nước máy sau khi ngâm. Nuôi trứng trong môi trường nước máy có độ pH = 7,2.
Nghiên cứu thực nghiệm có đối chứng [40].
Phương pháp đưa trứng Fasciola spp vào ngăn sinh khí của bể biogas
Dùng 3 túi vải dầy, đưa vào mỗi túi 100 trứng Fasciola spp. Đầu các túi buộc chặt và cả 3 túi được buộc vào một thanh tre có chiều dài 1,5m. Đưa 3 túi trứng vào ngăn sinh khí của bể biogas qua cửa điều áp. Giữ trứng trong bể theo các mức thời gian 10 ngày, 20 ngày và 30 ngày.
+ Đo nhiệt độ bể biogas và nhiệt độ phòng thí nghiệm bằng nhiệt kế bách phân.
+ Đo pH của nước bể biogas bằng máy đo Inolav.
đánh giá sức sống của trứng qua hình thái, màu sắc và biến đổi tế bào phôi trong trứng.
+ Trứng còn sống: tế bào phôi vẫn phân chia và phát triển tới
Miracidium, so sánh đối chứng.
+ Trứng chết: tế bào phôi hoàn toàn không phân chia sau 30 ngày nuôi, trứng không phát triển được tới Miracidium, so sánh đối chứng.
Trong thời gian nuôi trứng, mỗi ngày đảo trứng một lần và cứ 2 ngày lại thay nước một lần để chống nấm và vi sinh vật. Đo nhiệt độ phòng thí nghiệm 2 lần/ngày, sáng lúc 9 giờ, chiều lúc 3 giờ.