Thực hiện kiểm tra kháng thể kháng virus Gumboro bằng phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay).
Nguyên lý
Kỹ thuật ELISA là phản ứng huyết thanh học dựa vào phản ứng miễn dịch học giữa kháng nguyên và kháng thể chuẩn. Kháng nguyên hoặc kháng thể trong mẫu huyết thanh dương tính sẽ được gắn kết với kháng thể hoặc kháng nguyên đã được gắn sẵn trong giếng. Thành phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi, phần giữ lại tiếp tục kết hợp với Conjugate (chất kết hợp) có enzyme peroxidase. Phản ứng
chuyển màu (từ không màu thành màu xanh dương) khi có sự tham gia của cơ chất Chromagen. Mức độ màu thể hiện ở mỗi giếng tương ứng với hàm lượng kháng thể ở mỗi mẫu xét nghiệm. Máy đọc ở bước sóng phù hợp sẽ xác định lượng kháng thể hoặc kháng nguyên bị giữ lại trong giếng.
Phương pháp thực hiện
Chuẩn bị mẫu:
Cho 500l dung dịch pha mẫu vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng (đĩa sạch). Đĩa này được gọi là đĩa pha loãng huyết thanh. Sau đó thêm 1l huyết thanh cần kiểm tra vào mỗi giếng (pha loãng theo tỷ lệ 1:500). Bắt đầu với giếng A5 và kết thúc bằng giếng H12 (di chuyển trái sang phải) như hình 3.1:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A + + - - 1 2 3 4 5 6 7 8 B 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 C 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 D 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 E 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 F 57 57 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 G 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 H 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92
Hình 3.1 Sơ đồ bố trí huyết thanh xét nghiệm ELISA
Dùng máy lắc trộn đều mẫu huyết thanh và dung dịch pha mẫu sau đó mới chuyển mẫu pha loãng sang đĩa phản ứng có hấp phụ kháng nguyên (virus Gumboro).
Quy trình thực hiện phản ứng
1. Ghi lại vị trí của mẫu bố trí trên đĩa
2. Cho 100 l đối chứng dương tính không pha loãng vào giếng A1 và A2 3. Cho 100 l đối chứng âm tính không pha loãng vào giếng A3 và A4 4. Cho 100 l mẫu đã pha loãng vào đúng vị trí các giếng còn lại. 5. Ủ đĩa trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
7. Cho 350l nước cất vào mỗi giếng, sau đó loại bỏ các chất lỏng. Lập lại việc rửa 3 - 5 lần.
8. Cho 100l dung dịch Conjugate vào mỗi giếng. 9. Ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
10. Lặp lại bước 6 và 7 ở trên.
11. Cho 100l dung dịch TMB vào mỗi giếng. 12. Ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.
13. Cho 100l dung dịch Stop vào mỗi giếng.
14. Đo và đọc kết quả bằng máy ELISA ở bước sóng 650nm.
Tính toán kết quả
- Trung bình đối chứng dương (PCX) = Giếng 1 + Giếng 2 2
- Trung bình đối chứng âm (NCX) = Giếng 3+ Giếng 4 2
- Tỷ số S/P= OD mẫu - NCX
PCX – NCX
- Hiệu giá kháng thể (X): Log10 X = 1,09 (log10 S/P) + 3,36 X = 10 ^ [1,09 (log10 S/P + 3,36)]
Kết quả
Kết quả IBD ELISA có giá trị khi mật độ quang học trung bình (OD) của đối chứng huyết thanh âm tính là nhỏ hơn 0,150 và trung bình dương tính lớn hơn 0,750. Nếu một trong những giá trị này vượt ra khỏi phạm vi, kết quả xét nghiệm IBD nên được coi là không hợp lý và mẫu phải được kiểm tra lại. Giá trị S/P trong phạm vi nhỏ hơn hoặc bằng 0,2 (hiệu giá kháng thể 396) cho kiểm tra huyết thanh âm tính và lớn hơn 0,2 cho kiểm tra huyết thanh dương tính.