Vật liệu thí nghiệm

Vật liệu và dụng cụ

Ống tiêm y tế 1ml, 3ml, găng tay, khẩu trang, cân, sổ ghi chép, viết, ống nghiệm, thùng trữ lạnh, máy ly tâm, eppendorf, micropipet, kéo, parafilm,...

Mẫu vật và sinh phẩm

Mẫu huyết thanh gà thí nghiệm.

Vaccine phòng bệnh đậu gà, vaccine phòng bệnh cúm gia cầm, vaccine phòng bệnh Newcastle, vaccine tụ huyết trùng gia cầm, vaccine nhược độc phòng bệnh Gumboro BAL-IBD do Bestar Laboratories PTE LTD Singapore sản xuất.

Dung dịch sinh lý 0,85%, nước cất, ELISA kit (USA) do công ty Thịnh Á phân phối

Thành phần bộ kit:

STT Thành phần Số lƣợng

1 Đĩa 96 giếng đã hấp phụ kháng nguyên 5

2 Đối chứng dương 1,9 ml

3 Đối chứng âm 1,9 ml

4 Conjugate 50 ml

5 Dung dịch pha loãng mẫu 253 ml

6 Dung dịch TMB 60 ml

7 Dung dịch Stop 60 ml

3.3 Phƣơng pháp tiến hành

3.3.1 Phương pháp nuôi gà thí nghiệm

Nhiệt độ là yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến hiệu quả của giai đoạn nuôi khởi động trong 8-10 ngày đầu tiên, gà con rất mẫn cảm với nhiệt độ khả năng điều tiết thân nhiệt của gà con rất kém. Để gà con sinh trưởng và phát triển tốt thì trong giai đoạn úm cần chiếu sáng 24/24h. Sử dụng chụp úm bằng kim loại có bóng đèn tròn 75W (2 đèn/100 gà con). Xung quanh chuồng được che kín tránh mưa tạt, gió lùa.

Gà được cho ăn uống tự do, sử dụng thức ăn C225 và C235 của công ty Proconco (Pháp), bổ sung thêm Bcomplex, vitamin C, Vimecox phòng bệnh cầu trùng.

Mật độ nuôi:

1 ngày đến 2 tuần tuổi: 50 con/m2 2 tuần đến 3 tuần tuổi: 35 con/m2 3 tuần đến 4 tuần tuổi: 30 con/m2 4 tuần đến 5 tuần tuổi: 25 con/m2 5 tuần đến 6 tuần tuổi: 20 con/m2 6 tuần đến 7 tuần tuổi: 15 con/m2

Quy trình phòng bệnh chung

Trong quá trình thí nghiệm, gà thí nghiệm được phòng đầy đủ các bệnh theo quy trình phòng bệnh chung.

Bảng 3.1 Quy trình phòng bệnh chung

3.3.2 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 7 con/nghiệm thức gồm 3 nghiệm thức và 3 lần lặp lại.

Nghiệm thức 1: gà được tiêm phòng vaccine đầy đủ theo quy trình phòng bệnh chung và lấy máu định kỳ để theo dõi khả năng đáp ứng miễn dịch.

Nghiệm thức 2: gà được tiêm phòng vaccine đầy đủ theo quy trình phòng bệnh chung nhưng không lấy máu, nhằm so sánh khả năng tăng trọng so với lấy máu định kỳ.

Nghiệm thức đối chứng: gà được tiêm phòng theo quy trình phòng bệnh chung nhưng không tiêm vaccine Gumboro và lấy máu định kỳ để kiểm tra kháng thể thụ động.

Ngày tuổi Tên vaccine Tên công ty Cách tiêm ngừa

3 7 10 15 18 21 30 40 Lasota Gumboro Đậu Cúm A H5N1 Lasota Gumboro Cúm A H5N1 Tụ huyết trùng Navetco Bestar Navetco Navetco Navetco Bestar Navetco Navetco Nhỏ mắt mũi Nhỏ mắt mũi Chủng qua cánh Tiêm dưới da cổ Nhỏ mắt mũi Nhỏ mắt mũi Tiêm dưới da cổ Tiêm dưới da cổ

Bảng 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Lặp lại (lần)

Số gà trong thí nghiệm

Nghiệm thức I Nghiệm thức II Nghiệm thức đối chứng

1 7 7 7

2 7 7 7

3 7 7 7

3.3.3 Phương pháp lấy mẫu

- Phương pháp lấy máu để kiểm tra kháng thể:

+ Để xác định hàm lượng kháng thể thụ động ở gà con, tiến hành lấy máu ở tim vào lúc 3, 10 ngày tuổi và tĩnh mạch cánh lúc 17, 24 ngày tuổi, mỗi con 0,5ml máu.

+ Để xác định hàm lượng kháng thể sau khi tiêm phòng vaccine. Tiến hành lấy máu ở tĩnh mạch cánh của gà sau khi tiêm vaccin lần 2 được 2 tuần (35 ngày tuổi), 4 tuần (49 ngày tuổi) và sau đó lấy định kỳ mỗi tháng một lần. Số mẫu cần lấy trong mỗi lần là 30% số gà thí nghiệm tương đương 7 mẫu. Mỗi con lấy 0,5- 1ml máu cho vào ống nghiệm, ghi lại ký hiệu của gà thí nghiệm, khi lấy phải sát trùng bằng cồn 700. Đặt ống nằm nghiêng cho máu đông đến khi có huyết thanh đem ly tâm 2000 vòng/phút trong 15 phút, chiết lấy huyết thanh cho vào ống eppendorf bảo quản ở - 200C cho đến khi xét nghiệm.

3.3.4 Phương pháp xét nghiệm

Thực hiện kiểm tra kháng thể kháng virus Gumboro bằng phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay).

Nguyên lý

Kỹ thuật ELISA là phản ứng huyết thanh học dựa vào phản ứng miễn dịch học giữa kháng nguyên và kháng thể chuẩn. Kháng nguyên hoặc kháng thể trong mẫu huyết thanh dương tính sẽ được gắn kết với kháng thể hoặc kháng nguyên đã được gắn sẵn trong giếng. Thành phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi, phần giữ lại tiếp tục kết hợp với Conjugate (chất kết hợp) có enzyme peroxidase. Phản ứng

chuyển màu (từ không màu thành màu xanh dương) khi có sự tham gia của cơ chất Chromagen. Mức độ màu thể hiện ở mỗi giếng tương ứng với hàm lượng kháng thể ở mỗi mẫu xét nghiệm. Máy đọc ở bước sóng phù hợp sẽ xác định lượng kháng thể hoặc kháng nguyên bị giữ lại trong giếng.

Phương pháp thực hiện

Chuẩn bị mẫu:

Cho 500l dung dịch pha mẫu vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng (đĩa sạch). Đĩa này được gọi là đĩa pha loãng huyết thanh. Sau đó thêm 1l huyết thanh cần kiểm tra vào mỗi giếng (pha loãng theo tỷ lệ 1:500). Bắt đầu với giếng A5 và kết thúc bằng giếng H12 (di chuyển trái sang phải) như hình 3.1:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A + + - - 1 2 3 4 5 6 7 8 B 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 C 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 D 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 E 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 F 57 57 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 G 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 H 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí huyết thanh xét nghiệm ELISA

Dùng máy lắc trộn đều mẫu huyết thanh và dung dịch pha mẫu sau đó mới chuyển mẫu pha loãng sang đĩa phản ứng có hấp phụ kháng nguyên (virus Gumboro).

Quy trình thực hiện phản ứng

1. Ghi lại vị trí của mẫu bố trí trên đĩa

2. Cho 100 l đối chứng dương tính không pha loãng vào giếng A1 và A2 3. Cho 100 l đối chứng âm tính không pha loãng vào giếng A3 và A4 4. Cho 100 l mẫu đã pha loãng vào đúng vị trí các giếng còn lại. 5. Ủ đĩa trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.

7. Cho 350l nước cất vào mỗi giếng, sau đó loại bỏ các chất lỏng. Lập lại việc rửa 3 - 5 lần.

8. Cho 100l dung dịch Conjugate vào mỗi giếng. 9. Ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.

10. Lặp lại bước 6 và 7 ở trên.

11. Cho 100l dung dịch TMB vào mỗi giếng. 12. Ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.

13. Cho 100l dung dịch Stop vào mỗi giếng.

14. Đo và đọc kết quả bằng máy ELISA ở bước sóng 650nm.

Tính toán kết quả

- Trung bình đối chứng dương (PCX) = Giếng 1 + Giếng 2 2

- Trung bình đối chứng âm (NCX) = Giếng 3+ Giếng 4 2

- Tỷ số S/P= OD mẫu - NCX

PCX – NCX

- Hiệu giá kháng thể (X): Log10 X = 1,09 (log10 S/P) + 3,36 X = 10 ^ [1,09 (log10 S/P + 3,36)]

Kết quả

Kết quả IBD ELISA có giá trị khi mật độ quang học trung bình (OD) của đối chứng huyết thanh âm tính là nhỏ hơn 0,150 và trung bình dương tính lớn hơn 0,750. Nếu một trong những giá trị này vượt ra khỏi phạm vi, kết quả xét nghiệm IBD nên được coi là không hợp lý và mẫu phải được kiểm tra lại. Giá trị S/P trong phạm vi nhỏ hơn hoặc bằng 0,2 (hiệu giá kháng thể 396) cho kiểm tra huyết thanh âm tính và lớn hơn 0,2 cho kiểm tra huyết thanh dương tính.

3.4 Các chỉ tiêu theo dõi

+ Tình trạng sức khoẻ của đàn gà sau khi tiêm vaccine

Phương pháp theo dõi tình trạng sức khoẻ của đàn gà sau khi tiêm vaccin: đàn gà sau khi tiêm ngừa vaccin Gumboro sẽ được ghi nhận và theo dõi tình trạng sức khoẻ, như có mệt mõi hay bỏ ăn sau khi tiêm vaccine hay không.

+ Tỷ lệ gà có đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng

+ Tỷ lệ dương tính với kháng thể (%) = Số mẫu dương tính x 100 Số mẫu kiểm tra

+ Theo dõi tốc độ tăng trưởng của gà qua các giai đoạn: giai đoạn nuôi úm (0-28 ngày tuổi), giai đoạn nuôi thịt (28 ngày tuổi-xuất chuồng) theo dõi bằng cách cân trọng lượng gà lúc 1 ngày tuổi, sau đó cân lại lúc kết thúc giai đọan úm và một lần nữa trước khi xuất chuồng lúc gà được 12 tuần tuổi, cân vào lúc sáng sớm trước khi cho gà ăn

Tăng trọng qua các = trọng lượng cuối - trọng lượng đầu giai đoạn (g/con) giai đoạn (g/con) giai đoạn (g/con)

+ Mức tiêu tốn thức ăn qua các giai đoạn

Cân lượng thức ăn đầu kỳ trước khi cho gà thí nghiệm ăn, sau đó cộng toàn bộ lượng thức ăn đã cho ăn trừ đi lượng thức ăn thừa lúc cuối kỳ.

HSCHTĂ = Tổng lượng thức ăn qua các giai đoạn Tăng trọng qua các giai đoạn

3.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu

Tất cả các số liệu thô được xử lý bằng phần mềm Excel. So sánh tăng trọng giữa các nghiệm thức bằng phép thử t của phần mềm minitab 16.0.

Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Tình trạng sức khoẻ của đàn gà sau khi tiêm vaccine

Qua ghi nhận được trong quá trình thí nghiệm, sau khi tiêm vaccine có 2 gà thí nghiệm có biểu hiện mệt mỏi, ăn ít hơn những con khác. Tuy nhiên trạng thái này trở lại bình thường ở ngày hôm sau, sau khi gà được nghỉ ngơi. Những biểu hiện ở trên có thể là do gà còn nhỏ, khi tiêm vaccine cầm bắt gà nên có biểu hiện mệt mỏi. Điều này chứng tỏ rằng vacine Bal-IBD B38 an toàn khi sử dụng không gây gây sốc cho đàn gà.

4.2 Kết quả kiểm tra kháng thể thụ động mẹ truyền trên gà tàu thí nghiệm

Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra kháng thể thụ động mẹ truyền trên gà tàu thí nghiệm

Ngày tuổi Số mẫu kiểm tra Số mẫu dƣơng tính Tỷ lệ (%) Tỷ số S/P (X±SE) Hiệu giá kháng thể (X±SE) 3 5 5 100 0,81±0,30 1877±758 10 5 5 100 0,44±0,05 930±108 17 5 3 60 0,20±0,02 394±31 24 5 0 0 0,12±0,02 236±38

X: giá trị trung bình, SE: sai số chuẩn

Kết quả bảng 4.1 cho thấy, kháng thể thụ động mẹ truyền ở gà con duy trì đến 10 ngày tuổi với tỷ lệ dương tính là 100% và kháng thể này đủ mức bảo hộ cho gà con đến 10 ngày. Tuy nhiên đến 17 ngày tuổi chỉ còn 60% gà tồn tại kháng thể thụ động, trung bình đều dưới ngưỡng bảo hộ, hiệu giá kháng thể giảm đáng kể dưới mức bảo hộ 394 so với 396. Theo nghiên cứu của (Lê Văn Hùng, 1996), nghiên cứu miễn dịch thu được trên các bệnh truyền nhiễm do virus (Newcastle, Gumboro) cho thấy khi gây miễn dịch cho gà mẹ nhiều lần bằng vaccine sống và sau đó bằng vaccine vô hoạt thì trong máu gà mẹ có hàm lượng kháng thể cao và kháng thể mẹ truyền cho gà con, bảo vệ đàn gà con được 4-5 tuần tuổi. Nếu gà mẹ chỉ chủng ngừa bằng vaccine nhược độc thì kháng thể truyền chỉ bảo vệ cho gà con 1-3 tuần. Nhưng kết quả nghiên cứu trên kháng thể chỉ bảo hộ được cho gà con đến 10 ngày tuổi, điều này có thể là do gà mẹ có hàm lượng kháng thể thấp hoặc đàn gà mẹ chủng ngừa không đầy đủ. Song các nghiên

cứu gần đây cho thấy kháng thể truyền từ gà mẹ truyền sang gà con không ổn định, lúc cao, lúc thấp, không đồng đều giữa các con trong đàn. Qua đó cho thấy việc tiêm phòng cho gà bằng vaccine đang gặp trở ngại lớn nhất là kháng thể thụ động mẹ truyền, nên quy trình tiêm phòng bằng vaccine cho gà con không có lịch rõ ràng và cũng không có lịch áp dụng chung cho tất cả mọi nơi (Nguyễn Xuân Bình và ctv, 2000).

4.3 Khả năng bảo hộ của vaccin Gumboro đối với giống gà tàu vàng

Bảng 4.2 Tỷ lệ đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm vaccine lần hai 14 ngày (lúc gà 35 ngày tuổi) Nghiệm thức Số mẫu kiểm tra Số mẫu dƣơng tính Tỷ lệ (%) Tỷ số S/P (X±SE) Hiệu giá kháng thể (X±SE) NT1 7 7 100 0,38±0,09 804±194 Đối chứng 7 0 0 0,03±0,02 46±29

NT1: sử dụng vaccine, X: giá trị trung bình, SE: sai số chuẩn

Qua kết quả bảng 4.2 cho thấy gà có tiêm phòng vaccine đều có đáp ứng miễn dịch 100% sau khi tiêm lần 2 được 14 ngày. Qua đó cho thấy vaccine đảm bảo đúng khuyến cáo của nhà sản xuất. Điều này phù hợp với nhận định của Lê Văn Năm (2004) tiêm vaccine sau 2-3 tuần cơ thể mới tạo miễn dịch, vì bình thường lúc đầu khi kháng nguyên mới vào cơ thể đã kích thích hệ thống miễn dịch nhưng cơ thể không thể sản sinh ra ngay kháng thể mà phải trải qua một thời gian nhất định. Bên cạnh đó, hiệu giá kháng thể đạt 804±194 đủ bảo hộ gà chống lại bệnh Gumboro. Theo tiêu chuẩn xét nghiệm của ELISA kit của hãng Idexx cho rằng hiệu giá 396 đủ bảo hộ gà. Trong khi đó những gà không tiêm phòng vaccine thì lúc 35 ngày tuổi hiệu giá kháng thể giảm đến mức thấp, gà hoàn toàn mẫn cảm với bệnh. Từ kết quả trên chứng tỏ gà có đáp ứng miễn dịch tốt với vaccine đang sử dụng.

Nhằm theo dõi độ dài miễn dịch sau khi tiêm chúng tôi tiếp tục khảo sát hiệu giá kháng thể vào thời điểm gà được 49 ngày tuổi và 80 ngày tuổi, kết quả đươc thể hiện qua bảng 4.3 và 4.4

Bảng 4.3 Tỷ lệ đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm vaccine lần hai 28 ngày (lúc gà 49 ngày tuổi) Nghiệm thức Số mẫu kiểm tra Số mẫu dƣơng tính Tỷ lệ (%) Tỷ số S/P (X±SE) Hiệu giá kháng thể (X±SE) NT1 7 7 100 2,24±0,21 5527±561 Đối chứng 7 0 0 0,01±0,01 11±8

NT1: sử dụng vaccine, X: giá trị trung bình, SE: sai số chuẩn

Từ kết quả bảng 4.3 cho thấy gà có tiêm phòng vaccine cho đáp ứng miễn dịch cao 100% gà đều có kháng thể và hiệu giá kháng thể đạt 5527±561 với hiệu giá kháng thể này đảm bảo miễn dịch chắc chắn cho đàn gà. Tại thời điểm sau 28 ngày tiêm phòng lần 2 thì hiệu giá tăng cao hơn so với 14 ngày (804±194). Kết quả này phù hợp với nhận định của Phan Văn Lục (1999), sau khi tiêm vaccine Gumboro nhũ dầu vô hoạt cho gà, hàm lượng kháng thể Gumboro trong máu gà đạt đỉnh cao vào tuần thứ 4. Khi sử dụng vaccine Busaplex chống bệnh Gumboro cho gà đạt hiệu giá kháng thể bảo hộ lúc 42 ngày tuổi là cao nhất (Hoàng Thị Mỹ Hiền, 2009).

Bảng 4.4 Tỷ lệ đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm vaccine lần hai lúc gà 80 ngày tuổi

Nghiệm thức Số mẫu kiểm tra Số mẫu dƣơng tính Tỷ lệ (%) Tỷ số S/P (X±SE) Hiệu giá kháng thể (X±SE) NT1 7 7 100 3,15±0,14 7997±392 Đối chứng 7 0 0 0 0

NT1: sử dụng vaccine, X: giá trị trung bình, SE: sai số chuẩn

Kết quả bảng 4.4 cho thấy kháng thể vẫn được duy trì ở mức cao, đảm bảo đến giai đoạn xuất chuồng. Hàm lượng kháng thể tại thời điểm 80 ngày cho hiệu giá kháng thể cao nhất 7997±392. Vì đây là đáp ứng miễn dịch chủ động, vaccine Bal-IBD là loại vaccine sống. Khi tiêm vaccine sống thì sẽ cho đáp ứng miễn dịch bền và kéo dài. Theo Nguyễn Bá Hiên (2007), vaccine khi đưa vào cơ thể gà sẽ kích thích cơ thể tạo ra kháng thể, đây là loại kháng thể do cơ thể tạo ra nên nó có tính bền và lâu hơn, hơn nữa đây là loại vaccine sống có khả năng gây đáp ứng miễn dịch mạnh, chúng nhân lên trong cơ thể vật chủ và tiếp tục tạo ra kích thích của kháng nguyên trong một khoảng thời gian. Trong khi đó ở nghiệm thức không tiêm phòng vaccine hiệu giá kháng thể giảm đến mức không thể phát hiện qua phản ứng ELISA. Qua đó cho thấy việc tiêm phòng vaccine 2 lần đảm bảo

cho đàn gà thịt đến giai đoạn xuất bán thì hàm lượng kháng thể vẫn đủ khả năng