1.3.2.1. Phương pháp sắc ký khí
* Sơ đồ thiết bị sắc ký khí:
Hình 1.10 Sơ đồ thiết bị sắc ký khí
A: khí mang E: Detector
B: bộ lọc F: lò cột
C: buồng tiêm mẫu G: thiết bị ghi nhận tín hiệu D: cột
* Nguyên tắc chung của phương pháp sắc ký khí
Nguyên tắc của phương pháp này là dòng khí mang được cấp liên tục từ bộ phận cấp khí qua cổng bơm mẫu, tại đây mẫu được bơm vào dưới dạng lỏng hoặc khí, nhờ nhiệt độ cao, các chất đều được hóa hơi và dòng khí mạng đưa toàn bộ mẫu hoặc một phần đi vào cột tách. Tại cột tách, nhờ lực tương tác khác nhau của các pha tĩnh trong thành cột (với cột mao quản) và các hạt pha tĩnh (với cột nhồi), mà các chất ra khỏi cột đến detector với những khoảng thời gian khác nhau. Tại detector, mỗi chất khi đến nơi đều được nhận biết bằng việc thay đổi thế điện hoặc nhiệt so với dòng khí mang ổn định khi không có chất. Mỗi sự thay đổi này đều được chuyển thành tín hiệu điện, khuếch đại, lưu trữ thông qua bộ xử lý số liệu và được in ra dưới dạng sắc ký đồ [2, 4].
* Một số detector thường sử dụng của phương pháp: detector ECD, FTD, FPD, FID, MS, TCD.
* Ưu, nhược điểm của phương pháp Ưu điểm:
Thời gian phân tích nhanh; hiệu quả tách cao; độ nhạy cao, cực tiểu phát hiện đạt ppm – ppb; không phân hủy mẫu, có khả năng ghép nối với MS; độ chính xác cao, độ lệch chuẩn tương đối; lượng mẫu nhỏ; không đắt.
Nhược điểm:
- Phạm vi áp dụng của phương pháp hạn chế (sử dụng cho các hợp chất dễ bay hơi);
- Không phù hợp với các chất phân hủy nhiệt;
- Gặp khó khăn với các mẫu phức tạp, phải mất nhiều thời gian để chuẩn bị mẫu. - Đòi hỏi phải có detector khối phổ - MS để định danh chính xác chất.
1.3.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng
* Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng:
Hình 1.11. Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng * Nguyên tắc chung của phương pháp sắc ký lỏng
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn). Mẫu phân tích được đưa vào cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha
tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [2, 4].
* Các detector thường sử dụng của phương pháp: Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS, Detector huỳnh quang RF, Detector khối phổ MS…
* Ưu, nhược điểm của phương pháp Ưu điểm:
- Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất; - Không cần làm bay hơi mẫu;
- Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột; - Độ nhạy cao (ppm - ppb);
- Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1 – 100µl).
Nhược điểm:
- Thời gian làm sạch và ổn định cột sau các lần chạy lâu; - Thiết bị đắt tiền và tốn nhiều dung môi pha động tinh khiết.
1.3.2.3. Giới thiệu phương pháp sắc kí lỏng khối phổ a. Giới thiệu
Sắc ký lỏng ghép khối phổ là một thiết bị lý tưởng cho các phòng thí nghiệm. LC/MS là phương pháp được dùng trong phân tích vết và các hợp chất cần nhận danh chính xác vì trong những điều kiện vận hành nhất định ngoài thời gian lưu đặc trưng, hóa chất còn được nhận danh bằng khối phổ của nó. Độ nhạy LC/MS tùy thuộc vào hợp chất cần phân tích và giao diện sử dụng. Trong sắc ký lỏng ghép khối phổ, hỗn hợp chất phân tích sau khi tách ra khỏi cột sẽ đi qua một đường truyền đến đầu dò khối phổ. Cột sắc ký lỏng cho phép tách chất cần quan tâm, khối phổ cho phép tách ion cần quan tâm và cho biết phân tử lượng của chất phân tích.
Một hệ LC/MS cơ bản gồm hệ thống bơm sắc ký lỏng, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký, đầu dò khối phổ.
Hình 1.12. Sơ đồ ghép nối LC-MS
b. Detector khối phổ MS (Mass Spectrometry)
Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng
và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa,... Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất.
Nguồn ion
Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn tới nguồn ion để chuyển thành dạng hơi và được ion hóa nguyên tử. Một số kĩ thuật ion hóa được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như: ion hóa phun điện tử (electrospray ionization – ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (atmospheric-pressure chemical ionization – APCI), ion hóa bắn phá nguyên tử nhanh (fast-atom bombardment – FAB). Dưới đây là hai phương pháp ion hóa được sử dụng trên thiết bị Finnigan LCQDUO:
Ion hóa phun điện tử – ESI
Kĩ thuật này chuyển hóa các ion từ dung dịch lỏng thành các ion ở dạng khí. Dung dịch mẫu được dẫn vào vùng có trường điện từ mạnh được duy trì ở hiệu điện thế cao 4kV. Tại đây, dung dịch mẫu bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện và được hút tĩnh điện tới lối vào của thiết bị phân tích khối phổ. Các giọt nhỏ trước khi vào thiết bị phân tích khối phổ sẽ được kết hợp với dòng khí khô để làm bay hơi dung môi. Có 2 chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dương và ion âm.
Đây là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao. Kĩ thuật này ứng dụng phân tích các chất không phân cực như: protein, peptit, cacbonhydrat, nucleotit, polyetilen glycocol,... và các chất phân cực có khối lượng phân tử nhỏ.
Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển – APCI
Đây cũng là một kĩ thuật ion hóa mềm. APCI được sử dụng để phân tích các chất có khối lượng phân tử trung bình. Kĩ thuật này có thể bắn phá ở 2 chế độ: ion âm và ion dương.
Chất phân tích và dung môi ở dạng lỏng được chuyển thành các giọt nhỏ rồi hóa hơi ở nhiệt độ cao khoảng 500C. Một điện thế cao từ 3 – 5kV tạo ra các electrron và ion hóa chất phân tích. Đối với kĩ thuật APCI bắn phá với chế độ ion dương, sự ion hóa mẫu được thực hiện qua 3 giai đoạn:
Giai đoạn thứ nhất: e N2 N2. 2e Giai đoạn thứ hai: 2 2 2 .
. 2 H ON H O N . 3 2 . 2O H O H O HO H
Giai đoạn thứ ba: H3O M (M H)H2O
APCI là một kĩ thuật ion hóa mạnh, nó không bị ảnh hưởng khi thay đổi đệm chạy và nồng độ đệm. Nó được sử dụng để ion hóa các chất có khối lượng phân tử nhỏ (có khối lượng phân tử < 2000u).
Bộ phận phân tích khối lượng
Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser)
Tứ cực được cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống để các ion bay qua. Một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng một chiều (DC) và điện thế tần số radio (RF). Các tứ cực được đóng vai trò như một bộ lọc khối. Khi một trường điện từ được áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z và trường RF. Chỉ những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua được bộ lọc này.
Bộ phân tích bẫy ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser)
Loại thiết bị này bao gồm một điện cực vòng (ring electrode) với nhiều điện cực bao xung quanh, điện cực đầu cột (end-cap electrode) ở trên và ở dưới. Trái với lại thiết bị tứ cực ở trên, các ion sau khi đi vào bẫy ion theo một đường cong ổn định được bẫy lại cho đến khi một điện áp RF được đặt trên điện cực vòng. Các ion khác nhau m/z sau đó trở nên không ổn định và sẽ có hướng đi về phía detector. Do điện áp RF khác nhau trong hệ thống này mà thu được một phổ khối lượng đầy đủ.
Bộ phân tích thời gian bay (Time of Flight Analyser)
Phân tích thời gian bay dựa trên cơ sở gia tốc các ion tới detector với cùng một năng lượng. Do các ion có cùng năng lượng nhưng lại khác nhau về khối lượng nên thời gian đi tới detector sẽ khác nhau. Các ion nhỏ hơn sẽ đi tới detector nhanh hơn do có vận tốc lớn hơn còn các ion lớn hơn sẽ đi chậm hơn, do vậy, thiết bị này được gọi là thiết bị phân tích thời gian bay do tỉ số m/z được xác định bởi thời gian bay của các ion. Thời gian bay của một ion tới detector phụ thuộc vào khối lượng, điện tích và năng lượng động học của các ion.
Bộ phận phát hiện
Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối lượng, các ion được đưa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển. Có hai loại bộ phận phát
Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao. Các ion đập vào bề mặt dinot làm bật ra các electron. Các electron thứ cấp sau đó được dẫn tới các dinot tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron.
Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống như thiết bị nhân electron, các ion ban đầu đập vào một dinot tạo ra dòng các electron. Khác với detector nhân electron, các electron sau đó sẽ va đập vào một màn chắn phôtpho và giải phóng ra các photon. Các photon này được phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động như thiết bị nhân electron.
c. Sắc ký lỏng khối phổ chuỗi LC/MS/MS [4]
Các kỹ thuật ion hóa dùng trong LC-MS hầu hết là các kỹ thuật ion hóa mềm, hình thành các ion phân tử là chủ yếu, ít phân mảnh, vì vậy ít thông tin về cấu trúc các chất.
Có 2 kỹ thuật có thể phân mảnh tốt hơn, từ đó đưa ra nhiều thông tin hơn về cấu trúc các chất là phun điện tích và ion hóa hóa học với áp suất khí quyển (atmotpheric pressure chemical ionization - APCI) và kỹ thuật chuỗi khối phổ (MS-MS).
Có 4 kỹ thuật thực nghiệm được áp dụng rộng rãi để phân tích là [4]: - Đo phổ khối lượng các ion hình thành trong hệ MS (product-ion scan) - Đo phổ khối lượng các ion ban đầu (precusor-ion scan)
- Kỹ thuật quét các ion với chênh lệch khối lượng là hằng số (constant – neutral – loss scan)
- Kỹ thuật quan sát riêng các ion sau phân ly từ các ion lựa chọn (selected decomposition monitoring - SDM).
Chương 2: THỰC NGHIỆM