Bước 6: Thu thập vùng chứa virus
Vùng chứa virus Không hình thành vùng chứa virus Không hình thành vùng chứa virus Hình thành 2 vùng nhiễu xạ rõ rệt => tạo 5 phân đoạn Hình thành 2 vùng nhiễu xạ rõ rệt => tạo 5 phân đoạn Thu thập Không thu thập
Thu 12 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1 mL Thu phân đoạn II, IV và cặn Thu phân đoạn II, IV và cặn
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 38
Ở lần tinh chiết 1, chúng tôi đã sử dụng tốc độ ly tâm là 34500 rpm để sa lắng virus (bước 4) và sử dụng máy trộn gradient để tạo gradient tỷ trọng
đường. Tuy nhiên, sau khi ly tâm gradient tỷ trọng, không có băng virus nào
được hình thành trong nệm tỷ trọng và cặn cũng hình thành nhiều ở đáy ống ly tâm. Việc lựa chọn tốc độ ly tâm 345000 rpm được dựa trên điểm giữa của
ống ly tâm nên có thể dẫn tới lực ly tâm ly tâm quá cao.
Ở lần tinh chiết thứ 2, chúng tôi đã giảm tốc độ ly tâm nhằm sa lắng virus xuống còn 28000 rpm, tương ứng với lực ly tâm 91500 g (tính theo
điểm cuối của ống ly tâm) và tăng tốc độ ly tâm gradient tỷ trọng lên 30000 rpm, tương ứng lực ly tâm 107000 g (tương tự khuyến cáo của phương pháp gốc). Tuy nhiên, tương tự ở lần tinh chiết 1, chúng tôi cũng không thu được băng virus trong nệm tỷ trọng. Để kiểm tra liệu có virus trong nệm tỷ trọng hay không, 12 phân đoạn nệm tỷ trọng được thu thập với lượng 1 mL/ phân
đoạn. Các phân đoạn này được kiểm tra bằng đo UV ở bước sóng 280 và 390 nm. Kết quả kiểm tra cho thấy tất cả các phân đoạn đều có kết quả như nhau và không có phân đoạn nào thể hiện chứa virus.
Ở lần tinh chiết 3, qui trình được thực hiện tương tự lần tinh chiết 2 ngoại trừ nệm tỷ trọng được tạo ra bằng phương pháp truyền thống trong đó các dung dịch đường với nồng độ khác nhau được cho vào tube ly tâm bằng pipet tự động theo thứ tự giảm dần. Năm nồng độ đường (10, 20, 30, 40 và 50%) đã được sử dụng để tạo nệm tỷ trọng. Kết quả sau khi ly tâm tỷ trọng cho thấy trong mỗi ống li tâm đều hình thành 2 vùng nhiễu xạ rõ rệt, tạo thành 5 phân đoạn như minh họa (Hình 3.6). Chúng tôi đã đo các phân đoạn theo chiều dọc của ống li tâm và kết quả cho thấy phân đoạn I: 5 cm, phân đoạn II: 0.8 cm (tương ứng vùng nhiễu xạ thứ nhất), phân đoạn III: 0.8 cm, phân đoạn IV: 0.8 cm (tương ứng vùng nhiễu xạ thứ 2) và phân đoạn V: 1.3 cm.
Lần tinh chiết 4 cho kết quả tương tự như lần tinh chiết 3.
Chúng tôi đã sử dụng kết quả ở lần tính chiết 3 và 4 cho các nghiên cứu tiếp theo. Phần cặn ởđáy được hòa trong 1.5 ml đệm phosphate 0.1M, pH 7.2
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39 chứa 0.85 % NaCl. Sau đó phân đoạn 2 và 4 được đem ly tâm ở 35000 rpm trong 30 phút. Cặn thu được ở bước này lại được hòa trong 1.5 ml đệm phosphate 0.1M, pH 7.2 chứa 0.85 % NaCl. Kết thúc quá trình tinh chiết chúng tôi thu được 3 phân đoạn cần cho các bước tiếp theo, đó là dịch virus của phân đoạn 2, 4 và phân đoạn cặn. Để kiểm tra sự có mặt của RYSV trong mẫu tinh chiết, chúng tôi đã đem dịch virus này đi kiểm tra trực tiếp bằng RT-PCR sử dụng với cặp mồi đặc hiệu gen L của virus RYSV là RY-L-F2 và là RY-L-R2. Kết quả kiểm tra có phản ứng dương tính ở dịch virus của phân
đoạn 4 và phân đoạn cặn. Kết quảđược trình bày ở Hình 3.6.
Chuẩn bị mẫu lá bệnh Nghiền lá bệnh với đệm chiết Acid hóa dịch nghiền
Siêu ly tâm virus Tạo gradient đường bằng máy Thu thập các phân đoạn
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 40
Hình 3.6 Phân đoạn virus bằng gradient tỷ trọng đường sucrose và kiểm tra RT- PCR các phân đoạn virus sau quá trình tinh chiết
Dựa vào kết quả chúng tôi tiến hành lấy dịch virus của phân đoạn IV và cặn để gây miễn dịch trên thỏ.
3.2. Nghiên cứu tạo kháng thể thỏ đặc hiệu RYSV từ phân tử virus tinh chiết chiết
3.2.1. Gây miễn dịch trên thỏ và kiểm tra sự có mặt của kháng thể virus
Thỏđược nuôi theo phương pháp truyền thống là cho ăn rau muống, rau lang, củ khoai lang, củ cà rốt và cám tăng trọng. Khi nuôi thỏ đã trưởng thành, có trọng lượng trên 2 kg, khỏe mạnh thì tiến hành tiêm thỏ.
Dịch virus RYSV tiếp theo được chúng tôi tiến hành gây miễn dịch trên thỏ bằng cách tiêm hỗn hợp 0.5 ml dịch virus và 0.5 ml chất hỗ trợ chống sốc (complete adjuvant cho lần đầu và incomplete adjuvant cho các lần sau) vào bắp đùi sau của thỏ. Quá trình tiêm được thực hiện liên tục 4 lần, mỗi lần trên 1 đùi và cách nhau 1 tuần.