1.8.1. Nguyên lý của phương pháp huyết thanh học và ứng dụng
Theo Gibbs & Harrison (1980), phương pháp dựa trên hiện tượng kháng nguyên gặp kháng thể đặc hiệu với nó thì xảy ra phản ứng kết tủa vẩn hoặc phản ứng ngưng kết. Khi virus (kháng nguyên) được tiêm vào cơ thể máu nóng (thỏ, chuột..) thì hệ miễn dịch hình thành kháng thể (Ig) đặc hiệu virus. Kháng thể thường hình thành trong máu trong vòng một tuần và chủ yếu là IgM. Hiệu quả kháng huyết thanh tăng dần trong vài ngày, sau đó giảm cho
đến khi chỉ còn rất ít kháng thể. Nếu thỏ được tiêm tiếp với cùng một kháng nguyên đó thì kháng thể sẽ được hình thành nhanh, nhiều hơn, trong đó chủ
yếu là IgG. IgG tồn tại trong máu thỏ lâu hơn IgM. Cả hai kháng thể này đều có đáp ứng miễn dịch, nhưng trong chẩn đoán virus thực vật thường sử dụng IgG. Hầu hết các virus thực vật đều có hoạt tính gây miễn dịch tốt hơn cho protein thực vật (Gibbs & Harrison).
Thực tế hiện nay, chẩn đoán bằng kỹ thuật huyết thanh học được ứng dụng đối với nhiều loại virus và một số bệnh vi khuẩn. Phương pháp này khá
đơn giản và chính xác với các kỹ thuật như khuyếch tán miễn dịch, điện di miễn dịch, latex và ELISA (phương pháp miễn dịch và liên kết men).
1.8.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ kháng thể
Tuyến tiêm
Virus có thểđược tiêm vào máu thỏ qua tĩnh mạch ở mép tai (ven), vào cơ bắp, thường là vào bắp đùi chân sau thỏ, vào mô liên kết ở dưới da hoặc hiếm hơn ở bàn chân (tiêm dưới da) hoặc thậm chí được tiêm vào hạch bạch huyết. Kháng thể thường đạt nồng độ tối đa khoảng 2 tuần sau khi tiêm ven, 4
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 17
Số lần tiêm và số lượng virus đem tiêm
Cùng một lượng virus nếu được tiêm làm nhiều lần sẽđược nhiều kháng thể hơn tiêm chỉ một lần. Matthew (1957) phát hiện thấy 4 lần tiêm mỗi lần 10µg virus TYMV (Turnip yellow mosaic virus), cách nhau 21 ngày đã tạo ra hiệu giá của kháng huyết thanh không tỷ lệ trực tiếp với số lượng virus tiêm vào.
Theo Webster (1968), ở các thời điểm khác nhau sau khi tiêm, kháng thể
tạo ra sẽ khác nhau không chỉ về loại mà còn tính đặc hiệu. Ông cho biết: sau khi tiêm, kháng thể hình thành đầu tiên là IgM có tính đặc hiệu rất thấp. IgM nhanh chóng biến mất và thay vào đó là IgG. Những kháng thể IgG đầu tiên hình thành có tính đặc hiệu rất cao, nếu tiếp tục tiêm, IgG sẽ tăng lên nhanh chóng nhưng tính đặc hiệu lại giảm đi. Do vậy, kháng huyết thanh lấy sớm sẽ
có hiệu giá thấp nhưng rất đặc hiệu và ngược lại.
Các chất tiêm cùng kháng nguyên
Nếu tiêm ven, dịch virus thường hòa trong dịch nước muối sinh lý 0.85% NaCl và chất lượng tối thiểu các chất gây độc cho thỏ như các muối phosphate, carbonate và các ion khác.
Nếu tiêm bắp, tiêm dưới da, dịch virus được trộn với các chất có tác dụng tăng cường hoạt tính miễn dịch. Chất phổ biến là Freurds adjuvant.
Thời gian giữa các lần tiêm
Cách hiệu quả nhất để tạo kháng huyết thanh cao khi tiêm thỏ là tiêm với số lượng virus trung bình (tối đa 1µg virus/ml) ở các khoảng thời gian cách nhau xa và có sử dụng adjuvant. Govier (1958), thấy tiêm PVX 2 lần bằng cách tiêm ven, mỗi lần cách nhau 1 tháng sẽ có hiệu giá kháng thể cao hơn 8 lần so với tiêm bắp 1 lần hoặc tiêm ven nhiều lần, mỗi lần cách nhau 2 tuần.
1.8.3. Các kỹ thuật ELISA
Theo Hull (2000), dựa vào quan hệ của kháng thể liên kết enzyme với kháng nguyên, ELISA có thểđược chia làm 2 nhóm (Hình 1.6) là:
- Nhóm trực tiếp (direct ELISA): kháng thể liên kết enzyme là kháng thể
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 18 - Nhóm gián tiếp (indirect ELISA): kháng thể liên kết enzyme không phải là kháng thể phát hiện kháng nguyên (ví dụ các kỹ thuật II, III, IV, V, VI, VI trong Hình 1.6).
ELISA cũng gồm rất nhiều kỹ thuật khác nhau. Hai kiểu phổ biến nhất thường áp dụng cho chẩn đoán virus thực vật là:
- Kẹp kép kháng thể (double antibody sandwich = DAS). Đây là kỹ thuật
được phát triển đầu tiên bởi Clark & Adams (1977). Trong kỹ thuật này, kháng thể IgG đặc hiệu virus được cố định vào bản ELISA có vai trò để bẫy virus. Tiếp theo, kháng thể đặc hiệu virus liên kết với enzyme alkaline phosphatase (AP) sẽ liên kết với virus bị bẫy và enzyme sẽ thủy phân một cơ
chất là nitrophenyl phosphate (NPP), vốn không màu thành nitrophenol phosphate có màu vàng. Trong Hình 1.6, ngoại trừ kỹ thuật II thì tất cả các kỹ
thuật còn lại đều là DAS-ELISA
- Bẫy kháng nguyên trước (plate-trapped antigen = PTA). Đây là một dạng đơn giản của ELISA (Mowat & Dawson, 1987). Trong kỹ thuật này, dịch cây chứa virus sẽđược cốđịnh trước vào giếng ELISA. Tiếp theo, kháng thể đặc hiệu virus tinh chiết hoặc phổ biến là kháng huyết thanh thô được cố định vào bản. Để phát hiện liên kết này, một kháng thể thứ hai liên kết với AP
đặc hiệu với kháng thể của virus sẽ được cho vào giếng. Trong Hình 1.6 Kỹ
thuật II là PTA-ELISA.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19
1.8.4. Chẩn đoán virus RYSV bằng ELISA
Các nghiên cứu vềứng dụng ELISA trong chẩn đoán rất ít. Takahashi et al (1988) đã thí nghiệm đánh giá 2 kỹ thuật ELISA dùng kháng thể đặc hiệu RYSV là kỹ thuật DAS-ELISA và kỹ thuật ELISA đơn giản hóa. Trong kỹ
thuật DAS- ELISA, tác giảđã thử nghiệm 1 loạt các đệm chiết mẫu khác nhau bao gồm đệm phosphate, đệm phosphate chứa NaCl và Tween20 (đệm PBS- T), đệm citrate và đệm Tris-Cl. Các tác giả kết luận rằng đệm PBS-T là đệm tốt nhất để chiết mẫu. Trong kỹ thuật ELISA đơn giản hóa, các tác giả đã ủ đồng thời dịch virus và kháng thể liên kết AP. Các tác giảđã chứng minh rằng bước kết hợp này không ảnh hưởng đến độ nhạy và tính đặc hiệu.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20
Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU