Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU
2.1Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Bệnh vàng lụi lúa (bệnh vàng lá di động) do Rice yellow stunt virus (RYSV).
2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: từ ngày 1/7/2013 đến ngày 1/8/2014.
- Địa điểm: Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới - Học viện nông nghiệp Việt Nam.
2.1.3 Vật liệu nghiên cứu
2.1.3.1 Vật liệu thử nghiệm tạo kháng huyết thanh và chẩn đoán ELISA
- Động vật dùng để sản xuất kháng huyết thanh là thỏđã trưởng thành, có sức khỏe tốt, trọng lượng ≥ 2kg, được nuôi tại Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới.
- Kháng thể thỏđơn dòng liên kết - AP (Sigma). - Kít tinh chiết kháng thể dùng protein A (Sigma). - Màng nitrocellulose (Sigma).
2.1.3.2 Hóa chất, dung dịch đệm, môi trường
- Đệm điện di agarose (1xTAE): 10 mM Tris-acetate, 0.5 mM EDTA (pH 7.8). - Đệm CTAB: 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinylpyrrolidone), 100 mM Tris-HCl pH 8.0 và 25 mM EDTA.
- Đệm TE, pH8: 10 mM Tris-Cl and 1 mM EDTA.
- Đệm chiết phân tử virus: 0.1 M citrate natri, pH 6.5 chứa 10 % đường sucrose, 0.2 % Na2SO3 và 4 % bột than hoạt tính.
- Đệm hòa virus: đệm phosphate 0.01 M, pH 7.2 chứa 0.85 % NaCl. - Dung dịch đường sucrose 12 %.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21 - Dung dịch đường sucrose 50 %.
- Đệm carbonate (pH 9.6) (1L): 1.59 g Na2CO3, 2.93 g NaHCO3, 0.02 g NaN3. Hòa các chất trong 900 ml H2O, chỉnh pH = 9.6 với HCl và lên thể tích 1L.
- Đệm PBS (pH 7.4): 8.0 g NaCl, 0.2 g KH2PO4, 1.15 g Na2HPO4.12H2O, 0.2 g KCl, 0.02 g NaN3. Hòa các chất trong 900 ml H2O, chỉnh pH = 4.4 và lên thể tích 1L.
- Đệm PBS-T: đệm PBS + 0.5 ml Tween 20 /L.
- Đệm hòa kháng huyết thanh và kháng thể liên kết AP: PBS-T+2% PVP +0.2% albumin.
- Đệm cơ chất (pH 9.6) (cho 1 L): 97 ml diethanolamine, 600 ml H2O, 0.02 g NaN3.
- Beta-mercaptoethanol (βME).
- Đệm chiết Chloroform: isoamyl alcohol (24:1). - Dung dịch 10 M LiCl.
- Chất nền NPP: nitrovinyl phosphate, dạng viên nén 5 mg/viên (Sigma).
2.1.3.3 Các enzyme và kit thương mại
- Revert Aid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit (hãng Fermentas):
kít tổng hợp sợi cDNA.
- ReverseDreamTaq (Fermentas): DNA polymerase chịu nhiệt. - Tripure (Roche): kít tinh chiết RNA tổng số.
2.1.3.4 Các thiết bị chủ yếu
• Máy PCR.
• Máy đọc ELISA.
• Máy li tâm và siêu li tâm. • Thiết bị điện di.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22