3.1 Chuẩn bị nguồn vật liệu tạo kháng nguyên
3.1.1 Điều tra bệnh vàng lụi vụ mùa 2013 tại Bắc Giang
Từ năm 2009, bệnh vàng lụi xuất hiện và gây bệnh khá nghiêm trọng tại một số tỉnh thành phố miền Bắc nước ta như: Bắc Giang, Hà Nội, Hà Nam, Hải Dương, Hải Phòng,… Điều tra, đánh giá, phát hiện sự có mặt của bệnh là rất quan trọng đối với việc nghiên cứu và kiểm soát bệnh.
Mục tiêu của nghiên cứu này là (i) đánh giá hiện trạng bệnh tại 1 trong những khu vực bị bệnh vàng lụi nặng nhất tại miền Bắc và quan trọng hơn là (ii) thu thập được nguồn mẫu bệnh cho các nghiên cứu tiếp theo.
Vụ mùa 2013, chúng tôi đã tiến hành điều tra thu mẫu tại 3 xã thuộc huyện Hiệp Hòa là Hòa Sơn, Quang Minh và Bắc Lý. Chúng tôi đã chọn một số ruộng điển hình để điều tra tỷ lệ bệnh (Bảng 3.1, Hình 3.1). Kết quảđiều tra cho thấy, vào giai đoạn đứng cái làm đòng, bệnh biểu hiện rõ triệu chứng. Tỷ lệ bệnh trên các ruộng điều tra thay đổi theo ruộng từ 39.20 – 100%. Bệnh
đều nặng trên cả 2 giống lúa điều tra là Khang dân và Nếp.
Các mẫu tại Bắc Giang thu được đều có triệu chứng điển hình: ban đầu chỉ có phiến lá biến vàng, các gân chính và gân phụ vẫn có màu xanh, khi bệnh nặng toàn bộ lá biến màu vàng- vàng cam, gân chính chuyển vàng sau cùng. Những ruộng xuất hiện triệu chứng chưa rộng có các dảnh lúa bị vàng tập trung ở ven bờ ruộng sau đó bệnh lan rộng và một số ruộng bị nặng thì cả
ruộng biến vàng. Bệnh xuất hiện muộn trong một số trường hợp cây vẫn cao vẫn phát triển, trỗ bông nhưng cho năng suất không cao.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32
Bảng 3.1 Điều tra bệnh vàng lụi vụ mùa 2013 tại Hiệp Hòa - Bắc Giang
Xã Giống Diện tích ước tính (sào) Tỷ lệ bệnh (%) Bắc Lý Khang dân 18 2.5 95.25 Khang dân 18 1.5 100 Khang dân 18 2 63.00 Nếp 1 47.55 Nếp 2 50.00 Hùng Sơn Khang dân 18 1.5 39.20 Khang dân 18 1 73.10 Nếp 1.5 56.30 Nếp 2 93.65
Quang Minh Khang dân 18 1 82.60
Khang dân 18 2 59.15
(Giai đoạn: lúa đứng cái – làm đòng. Điều tra 5 điểm chéo góc/ruộng, mỗi
điểm 40 khóm
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33 Vụ mùa 2014, chúng tôi tiếp tục điều tra thu mẫu lúa bệnh tại xã Hòa Sơn - Hiệp Hòa - Bắc Giang vàxã Ngọc Tảo - Phúc Thọ - Hà Nội. Chúng tôi
đã chọn một số ruộng điển hình để điều tra tỷ lệ bệnh (Bảng 3.2, Bảng 3.3, Hình 3.2). Kết quả điều tra cho thấy, vào giai đoạn lúa đẻ nhánh, bệnh biểu hiện rõ triệu chứng. Ở Bắc Giang tỷ lệ bệnh trên các ruộng điều tra thay đổi theo từng ruộng từ 13.90 – 90.00%, trong đó bệnh đều nặng trên giống lúa TH3-3. Ở Hà Nội tỷ lệ bệnh trên các ruộng điều tra dao động từ 14.00– 63.10%, trong đó giống Bắc Thơm bị bệnh nặng nhất. Các mẫu tại Bắc Giang và Hà Nội thu được đều có triệu chứng điển hình: ban đầu chỉ có phiến lá biến vàng, các gân chính và gân phụ vẫn có màu xanh, khi bệnh nặng toàn bộ lá biến màu vàng- vàng cam, gân chính chuyển vàng sau cùng.
Bảng 3.2 Điều tra bệnh vàng lụi vụ mùa 2014 tại xã Hòa Sơn - Hiệp Hòa -Bắc Giang Giống Diện tích (sào) Tỷ lệ bệnh (%) Bắc Thơm 1.5 22.20 Bắc Thơm 2 13.90 Bắc Thơm 2 20.80 Khang dân 18 1 19.00 Khang dân 18 2 17.40 Khang dân 18 1.5 21.50 TH 3-3 2 90.00
(Giai đoạn: lúa đẻ nhánh. Điều tra 5 điểm chéo góc/ruộng, mỗi điểm 40 khóm).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34 Bảng 3.3 Điều tra bệnh vàng lụi vụ mùa 2014 tại xã Ngọc Tảo - Phúc Thọ - Hà Nội Giống Diện tích (sào) Tỷ lệ bệnh (%) Khang dân 18 1.5 26.70 Khang dân 18 2 15.85 Khang dân 18 2 14.00 Bắc Thơm 2 59.85 Bắc Thơm 1 63.10 Bắc Thơm 1.5 60.75 Hương thơm Số 1 2 16.95 Hương thơm Số 1 1.5 14.80 Hương thơm Số 1 2 19.95
(Giai đoạn: lúa đẻ nhánh. Điều tra 5 điểm chéo góc/ruộng, mỗi điểm 40 khóm).
Hình 3.2 Bệnh vàng lụi lúa vụ mùa 2014 tại Hòa Sơn- Hiệp Hòa -Bắc Giang
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35
3.1.2. Phát hiện virus RYSV bằng RT-PCR trên các mẫu đã thu thập
Để sản xuất kháng huyết thanh, phải có mẫu virus tinh chiết từ cây bệnh. Do đó chúng tôi đã tiến hành thu thập mẫu cây bệnh với triệu chứng điển hình tại vùng dịch Bắc Lý và Hùng Sơn – Hiệp Hòa – Bắc Giang và Ngọc Tảo- Phúc Thọ - Hà Nội làm vật liệu khởi đầu. Mẫu bệnh sau khi thu thập được kiểm tra RT-PCR nhưở phần 4.2 và được trồng tại Trung tâm Bệnh cây nhiệt
đới (Hình 3.4) cho tới khi tinh chiết.
Bệnh vàng lụi lúa chuẩn đoán bằng quan sát triệu chứng thường không chính xác khi mẫu thử không biểu hiện triệu chứng đặc trưng, hoặc khi cây bệnh ở giai đoạn mới nhiễm. Đặc biệt triệu chứng vàng là do RYSV gây ra có thể rất dễ nhầm lẫn với các hiện tượng vàng lá sinh lý khác.
Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra sự có mặt của virus bằng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu gen L của virus RYSV là RY-L-F2 và là RY- L-R2. Cặp mồi này đã được thiết kế từ trước và tạo sản phẩm 422 bp (Hà Viết Cường et al.,2010). Mục tiêu của thí nghiệm này là để phát hiện sự mặt của virus tại vùng dịch và quan trọng hơn là khẳng định nguồn vật liệu tinh sạch virus cho sản xuất kháng huyết thanh (phần 4.2).
Chúng tôi tiến hành chiết RNA tổng số từ các mẫu bệnh bằng kít Tripure. Kết quả kiểm tra RT-PCR (Bảng 3.4 và Hình 3.3) cho thấy băng sản phẩm rất rõ và đặc hiệu, điều này chứng tỏ các mẫu cây bệnh với triệu chứng
điển hình nhiễm virus RYSV.
Bảng 3.4 RT-PCR phát hiện virus RYSV trên lúa vụ xuân 2013 tại Bắc Lý- Bắc Giang
TT Giống Triệu chứng Ngày thu Địa điểm RT- PCR