Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU
2.3Các phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp điều tra bệnh đồng ruộng
Điều tra bệnh vàng lụi trên một số tỉnh, thành phố phía Bắc nước ta (vào vụ mùa). Chỉ tiêu đánh giá:
• Mức độ triệu chứng bệnh.
• Tỉ lệ bệnh: Số cây có triệu chứng /số cây quan sát (điều tra 5 điểm chéo góc, mỗi điểm 40 khóm ( 1 m2), chọn ruộng điển hình bị bệnh).
2.3.2 Phương pháp thu thập và xử lý mẫu
Mẫu lúa và cỏ xung quanh khu ruộng nhiễm bệnh: • Triệu chứng bệnh. • Hình ảnh. • Địa điểm. • Thời gian thu thập. • Giống (đối với lúa), loài đối với cỏ. 2.3.3 Phương pháp bảo quản mẫu
Sử dụng 2 phương pháp bảo quản mẫu: bảo quản khô và bảo quản tươi. - Mẫu khô: mẫu thu về được cắt nhỏ đựng trong Effpendorf để trong hộp chứa Silicagel cho đến khi khô thì đậy nắp ống để giữ nguồn bệnh.
- Mẫu tươi: mẫu thu vềđược trồng trong các chậu hoặc trồng trực tiếp. Chăm sóc cây trong suốt quá trình làm để giữ nguồn bệnh.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23
2.3.4 Phương pháp nuôi rầy
- Rầy xanh đuôi đen thu bắt được thả trong các lồng nuôi rầy có cây lúa. Cần nắm được sinh trưởng và phát triển của rầy.
- Thường xuyên xem xét để biết được giai đoạn phát triển của rầy. - Lúa nuôi rầy không nên để thưa, lúa nuôi rầy rất nhanh bị lụi do rầy chích nên cần thay lúa, không để thiếu lúa trong lồng nuôi.
- Khi rầy vào giai đoạn rộ, rầy sinh trưởng và phát triển mạnh, mật độ
rầy cao. Cần san bớt rầy ra lồng khác để giữ mật độ rầy hợp lý, không gây chết rầy.
- Chú ý: do RYSV không truyền qua trứng vì vậy rầy non lứa sau sẽ
không bị bệnh. Lồng nuôi rầy bệnh cần phải cho xen cả lúa bệnh và không bệnh. Rầy khỏe cần ít nhất 2-3 ngày để nhiễm bệnh, lúa khỏe cần ít nhất 3 ngày để nhiễm bệnh, từđó ta có thể nhân nuôi rầy xanh nhiễm RYSV .
2.3.5 Phương pháp chiết RNA tổng số từ mô lá và rầy
Quy trình chiết tách RNA tổng số hoặc bằng kít Tripure theo hướng dẫn của nhà sản xuất hoặc bằng phương pháp LiCl của Chang et al. (1993).
Quy trình chiết theo phương pháp LiCl như sau:
- Trước khi chiết: ủ đệm CTAB + β-ME (10 µl/ ml đệm) ở 60 oC trong 30 phút bằng bể nhiệt.
- Lấy 0,2 g mô lá bệnh, nghiền trong 1ml đệm CTAB bằng chày cối sứ. Cho dịch nghiền vào tube 1,5ml, ủ 60 oC 30 phút.
- Li tâm 13000g trong vòng 5 phút để loại bỏ tàn dư, thu dịch trên tủa. - Cho Chloroform/Isoamyl (24:1) vào tube với thể tích tương đương, trộn đều.
- Li tâm 13000g trong vòng 10-15 phút, thu cặn RNA. - Rửa cặn 2 lần bằng Ethanol 70%.
- Để khô tự nhiên trong không khí tối thiểu là 30 phút.
- Hoà tan cặn RNA trong 50 µl nước cất vô trùng (hoặc nước DEPC) và bảo quản - 80 oC.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24 2.3.6 Phản ứng RT – PCR Sử dụng cặp mồi đặc hiệu gen L (RY-L-F2/RY-L-R2) tạo sản phẩm 422 bp. Trình tự các mồi này là: - RY-L-F2 AGGTACCAAGACGGCTCAACTATG - RY-L-R2 AAGGTGGGGAAGGTCGGAATC
Phản ứng RT-PCR được thực hiện với 2 enzyme Reverse Aid và Dreamtaq của hãng Fermentas. Phản ứng được thực hiện trong Effpendorf 0.5 ml chứa các thành phần sau: Tên Lượng (µl) H2O 15.6 Đệm DreamTaq (x10) 2.0 dNTPs 0.3 Mồi xuôi dòng 0.3 Mồi ngược dòng 0.3 ReverseAid 0.2 Dream Taq 0.3 RNA 1 Tổng thể tích 20
- Phản ứng RT – PCR được thực hiện theo các điều kiện sau: - Tổng hợp sợi cDNA trong 30 giây ở 45 oC.
- Khởi đầu biến tính 4 phút ở 94 oC.
- Tiến hành 35 chu kỳ phản ứng ở 94 oC trong 35 giây; 54 oC trong 35 giây; cuối 72 oC trong 1 phút.
- Cuối cùng là bước kết thúc ở 72 oC trong 5 phút.
2.3.7 Điện di agarose
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25
đem đun trong lò vi sóng để agarose tan hoàn toàn, sau đó bổ sung thêm 1µl dung dịch Ethidium bromide.
- Chuẩn bị khay đựng gel và chọn lược với lượng giếng thích hợp số
mẫu cần chạy điện di. Tiếp theo đổ gel khi nhiệt độ khoảng 50 oC. Khi gel
đông đem đặt vào bểđiện di, đổ ngập bản gel bằng đệm TAE.
- Cài mẫu: lấy 10 µl sản phẩm PCR + 2µl Loading Dye cho vào các giếng của bản gel.
- Điện di với hiệu điện thế 100V trong khoảng 30 phút. - Kiểm tra kết quả PCR dưới ánh sáng cực tím.
2.3.8 Tinh chiết phân tử virus RYSV
Quy trình chiết phân tử RYSV từ lúa và rầy được thực hiện theo quy trình chiết virus Cynodon chlorotic streak virus (CCSV) trên cỏ Bermuda (Lockhart et al.,1985). Các bước cụ thể như sau:
• Nghiền mẫu bệnh: khoảng 100 g mô lá lúa và rầy nhiễm RYSV (đã
được kiểm tra RT-PCR) được nghiền với 400 mL đệm citrate (sodium citrate) 0.1 M, pH 6.5 chứa 10 % đường sucrose, 0.2 % Na2SO3 và 4 % bột than hoạt tính. Mô lá được nghiền trong đệm lạnh bằng máy nghiền sinh tố. Lọc dịch nghiền bằng vải lọc.
• Acid hóa dịch nghiền: sau khi lọc dịch nghiền qua vải lọc, dịch được acid hóa tới pH 0.5 bằng nhỏ từ giọt acid acetic đậm đặc (acid acetic băng). Dịch được giữở 4 oC trong 2 – 4 giờ.
• Làm trong: dịch được làm trong bằng ly tâm ở 17400 g trong 20 phút bằng máy ly tâm Beckman Algera 64G. Lấy dịch trong và loại bỏ cặn.
• Sa lắng virus: sa lắng virus trong dịch trong ở trên bằng siêu ly tâm
ở 91500 g trong 30 phút (máy siêu ly tâm Beckman Optima L-90K). Hòa cặn virus trong đệm phosphate 0.01 M, pH 7.2 chứa 10 % đường sucrose và 0.85 % NaCl.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26 • Tách virus bằng ly tâm gradient tỷ trọng. Dịch virus ở trên được tách bằng ly tâm trên nệm gradient tỷ trọng đường sucrore (12-50%). Nệm tỷ
trọng được chuẩn bị với đệm phosphate 0.01 M, pH 7.2 chứa 0.85 % NaCl. Nệm tỷ trọng được ly tâm ở 107000 g trong 45 phút.
• Thu thập vùng chứa virus bằng xi ranh y tế.
• Kết tủa lại virus bằng ly tâm vùng chứa virus ở 139000 g trong 30 phút. Hòa cặn virus tinh chiết trong 1 mL đệm phosphate 0.01 M, pH 7.2 chứa 0.85 % NaCl. Đây là dịch virus đã tinh chiết. Kiểm tra dịch virus tinh chiết bằng RT-PCR và bảo quản ở - 20oC.
2.3.9 Tạo kháng huyết thanh virus trên thỏ
- Tiêm hỗn hợp gồm 0.5 mL dịch virus + 0.5 mL chất tăng cường miễn dịch (complet adjuvant) vào bắp đùi sau của thỏ. Tiêm 4 lần, mỗi lần cách nhau 1 tuần.
- Huyết thanh thỏ được thu thập sau lần tiêm thứ 2 từ động mạch tai của thỏ (khoảng 0.5 mL). Máu thỏ được ly tâm 13000g/ 5 phút và lấy dịch kháng huyết thanh trên tủ. Sự có mặt của kháng thể được đánh giá bằng phương pháp PTA- ELISA.
- Khi kháng thể virus hình thành đủ nhiều thì giết thỏ và thu thập toàn bộ kháng huyết thanh. Khi thử thấy hiệu giá kháng huyết thanh cao, tiến hành giết thỏđể thu toàn bộ máu.
- Máu thu từ thỏ, được làm đông trong vòng 24 giờ ở nhiệt độ 4oC. Sau
đó dùng lấy phần huyết tương ở trên để riêng. Phần máu thỏđông được ly tâm 10000g/15 phút để lấy dịch kháng huyết thanh sau li tâm. Phần này cũng được
để riêng.
- Huyết tương và kháng huyết thanh sau ly tâm được bổ sung NaN3 0,2% và bảo quản ở tủ lạnh sâu (- 20oC).
2.3.10 Phương pháp ELISA
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27 huyết thanh là phương pháp bẫy kháng nguyên trước (PTA-ELISA = Plate Trapped Entigen - ELISA) (Mowat & Dawson, 1987).
Các bước của một kỹ thuật PTA- ELISA chuẩn như sau:
Bước 1: Cố định dịch cây cần kiểm tra
- Nghiền 0,1 g mẫu lá cây cần kiểm tra trong đệm carbonate với tỉ lệ
lá/dung dịch đệm từ 1/5 – 1/30 (khối lượng/thể tích). - Ly tâm 3000 vòng/phút, thu lấy dịch trên tủa.
- Nhỏ dịch mẫu vào bản ELISA: 100 µl /giếng. Để bản ELISA vào hộp
ẩm và ủ qua đêm trong tủ lạnh.
- Rửa bản ELISA: tiến hành 3 lần bằng đệm PBS-T rồi rửa lại 3 lần bằng nước cất. Mỗi lần rửa cách nhau 1 phút.
Bước 2: Cố định kháng thể thỏ đặc hiệu virus
- Nghiền mẫu lá cây khoẻ trong dung dịch đệm kháng huyết thanh (PBS-T+ 2% PVP +2% Ovalbumin). Li tâm 10000g trong 15 phút và thu dịch trên tủa.
- Cho kháng huyết thanh vào dịch cây khoẻ theo tỷ lệ 1/100 – 1/1000, trộn đều và ủ ở 37oC trong 45 phút để hấp thụ chéo các kháng thể không đặc hiệu có trong kháng huyết thanh (kháng thể không đặc hiệu là kháng thể phản
ứng với protein của cây).
- Nhỏ vào mỗi giếng 100 µl dịch cây khoẻ chứa kháng huyết thanh ở
trên. Sau đó để bản ELISA trong hộp ẩm và để trong điều kiện 37 oC trong thời gian 2 - 4 giờ.
- Rửa bản ELISA (nhưở bước 1).
Bước 3: Cố định kháng thể chuột liên kết AP (Alkaline phosphatase)
đặc hiệu kháng thể thỏ.
- Pha kháng thể chuột liên kết AP đặc hiệu kháng thể thỏ trong đệm kháng huyết thanh theo tỉ lệ 1/5000.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28 - Để bản ELISA trong hộp ẩm và ủ trong điều kiện 37 ⁰C trong 2 - 4 giờ. Rửa bản ELISA (nhưở bước 1).
Bước 4: Cốđịnh chất nền (nitrophenyl photphat).
- Pha chất nền trong đệm cơ chất với lượng 1 mg/mL. - Nhỏ 100 µl dịch chất nền vào mỗi giếng.
- Để bản ELISA ở nhiệt độ phòng, trong tối, trong 30 - 60 phút.
- Đánh giá kết quả bằng mắt và đo mật độ quang OD (optical density) bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 405 nm.
2.3.11 Tinh chiết protein tổng số từ cây lúa bằng (NH4)2SO4
Chuẩn bị dịch chiết protein lúa
- Nghiền mô lúa (lá, thân) tươi (200 g) trong 400 mL đệm chiết (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 mM EDTA, 1 mM β-mercaptoethanol) bằng máy xay sinh tố.
- Lọc dịch chiết qua vải lọc, loại cặn.
- Ly tâm dịch lọc 5000g/4 oC/10 phút. Giữ lại dịch trên tủa, bỏ cặn.
Kết tủa protein tổng số bằng (NH4)2SO4
- Protein tổng số được kết tủa (NH4)2SO4 ở nồng độ 80% bão hòa (kết tủa phần lớn protein). Lượng (NH4)2SO4được tính dựa theo công thức tính theo:
- Thể tích dịch: 400 mL.
- Phần trăm (NH4)2SO4 bão hòa ban đầu: 0%. - Phần trăm (NH4)2SO4 bão hòa: 80 %.
- Điều kiện nhiệt độ: 25 oC.
=> Lượng (NH4)2SO4 = 226.8 g, thể tích cuối 523.27 ml (25 oC).
- Sau khi hòa tan (NH4)2SO4 (cho rất chậm, ~ 1 giờ), dịch potein được
để qua đêm ở 4 oC.
- Kết tủa protein bằng ly tâm 12000g/4 oC/15 phút. Giữ lại cặn (dịch trên tủa cũng được giữ lại cho các nghiên cứu tiếp nếu cần thiết).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29 - Toàn bộ cặn được thu thập vào ống falcon. Cặn protein trong (NH4)2SO4 có thể bảo quản lâu dài ở 4 oC mà không ảnh hưởng nhiều chất lượng protein.
2.3.12 Thẩm tích protein tổng số
Chuẩn bị màng thẩm tích. Sử dụng màng thẩm tích cellulose 0.45 µl (Sigma). Chuẩn bị màng (theo hướng dẫn của nhà sản xuất):
- Rửa màng để loại glycerin trong nước 3 - 4 giờ. Loại bỏ hợp chất lưu huỳnh bằng xử lý với 0.3 % (w/v) sodium sulfide ở 80 oC trong 1 phút.
- Rửa màng bằng nước nóng (60 oC) trong 2 phút, sau đó acid hóa với 0.2% (v/v) sulfuric acid. Cuối cùng rửa bằng nước nóng để loại bỏ acid. Màng tiếp theo được cân bằng với đệm PBS, pH 7.2 trong 5 phút.
- Thẩm tích 2 ml dịch protein chứa (NH4)2SO4: thẩm tích với 1L đệm PBSx1, pH 7.2 ở RT. Thay đệm 1 lần sau 10 giờ.
- Protein thẩm tích được bảo quản ở 4 oC cho phân tích tiếp theo.
2.3.13 Phương pháp loại bỏ kháng thể không đặc hiệu trong kháng huyết thanh bằng màng nitrocelluse
Sử dụng phương pháp loại bỏ kháng thể không đặc hiệu trong kháng huyết thanh “negative purification of antibodies” theo Rybicky et al. (1990) và Burbelo et al. (2002). Các bước như sau:
Bước 1: Màng nitrocellulose (cân bằng trước với nước) được ủ với dịch protein lúa hòa trong đệm PBS hoặc dịch chiết cây lúa khỏe. Thời gian ủ: ít nhất 2 giờở RT. Rửa màng 3 lần với PBS-T.
Bước 2: Khóa (block) màng với skin milk 5% trong đệm PBS ở ít nhất 2 giờ ở RT hoặc qua đêm. Rửa màng 3 x với PBS-T.
Bước 3: Màng được ủ với dịch kháng huyết thanh (được hòa loãng từ 10 – 50 lần trong đệm PBS) qua đêm ở 4 oC. Trong quá trình ủ, kháng thể không
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30 Bước 4: Dịch kháng huyết thanh sau khi ủđược sử dụng để kiểm tra ELISA.
2.3.14 Phương pháp loại bỏ kháng thể không đặc hiệu trong kháng huyết thanh bằng bản ELISA.
Bước 1: Nghiền 200g lúa khỏe trong 400ml đệm PBS x 1.
Bước 2: Lấy dịch cây lúa khỏe vừa nghiền được nhỏ vào 10 bản ELISA mới, ủ qua đêm. Rửa bản ELISA 3 lần với PBS-T.
Bước 3: Cho các nguồn KHT đi qua các bản ELISA để loại bỏ bớt kháng thể không đặc hiệu. Ủ trong 2 - 4 giờ, ở 37 oC.
Sau đó sử dụng KHT đi kiểm tra ELISA.
2.3.15 Phương pháp tinh sạch kháng thể bằng sắc ký cột Protein A
Sử dụng phương pháp loại bỏ kháng thể không đặc hiệu trong kháng huyết thanh qua cột Protein A (Sigma) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Các bước như sau:
Bước 1: Dùng nước cất cho chạy qua máy Miniplus 2 trong 15 - 20 phút. Sau đó dùng xylanh 10 mL, hút 10 mL đệm Hepes chạy qua Desalting Cartridge. Với tốc độ chạy 1 mL/1phút.
Bước 2: Dùng xylanh 5 mL, hút 5 mL đệm Regeneration chạy qua Protein A Cartridge. Với tốc độ chạy 1 mL /1phút.
Bước 3: Dùng xylanh 10 mL, hút 4 mL đệm Binding chạy qua Protein A Cartridge. Với tốc độ chạy 1 mL/1phút.
Bước 4: Lấy 2 mL kháng huyết thanh pha với 4 mL đệm Binding, sau
đó cho chạy qua Protein A Cartridge. Với tốc độ chạy 0,5 mL/1phút.
Bước 5: Thu được cặn 0.5 mL. Đây chính là kháng thể sau khi chạy qua sắc ký cột Proten A. Hòa với 4 mL đệm Binding. Kết quả thu được 4.5 mL kháng thể. Sau đó sử dụng KT đi kiểm tra ELISA.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31