Các nghiên cứu ựược thực hiện tại:
+ Phòng thắ nghiệm của Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III + Vùng sản xuất tôm giống tại Ninh Hải, Ninh Thuận
2.2. Sơ ựồ phương pháp luận của ựề tài luận văn
Hình 2.2: Sơ ựồ phương pháp luận của ựề tài luận văn 2.3. Phương pháp thu thập số liệu
2.3.1. điều tra xác ựịnh nguồn lây nhiễm Vibrio trong sản xuất giống tôm chân trắng
2.3.1.1. điều tra tình hình sản xuất, dịch bệnh trên tôm giống, khảo sát, ựánh giá quá trình xử lý nước, sử dụng hóa chất và chế phẩm sinh học nhằm xác ựịnh nguyên nhân lây nhiễm Vibrio và thu mẫu phân tắch một số tác nhân vi khuẩn có khả năng gây bệnh trên tôm giống
+ Phương pháp khảo sát trại sản xuất giống tôm chân trắng: điều tra cắt ngang dựa theo phương pháp của đào Ngọc Phong và cộng sự [10]: Nội dung ựiều tra gồm các thông tin về: hệ thống xử lý nước, kỹ thuật lọc/xử lý nước, kỹ thuật nuôi tôm bố
Khảo sát mức ựộ gây bệnh ở hậu ấu trùng tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) khi nhiễm Vibrio và
ựề xuất giải pháp phòng chống tại cơ sở sản xuất giống Ninh Hải, Ninh Thuận
điều tra xác ựịnh nguồn lây nhiễm
Vibrio trong trại giống
Xác ựịnh ngưỡng gây bệnh của 3 loài Vibrio
- Xác ựịnh nguồn lây nhiễm, mức ựộ nhiễm Vibrio
trên PL tôm thẻ chân trắng ở trại sản xuất giống - Xác ựịnh ựược ngưỡng gây bệnh của 3 loại Vibrio
trên PL tôm thẻ chân trắng.
- đề ra ựược giải pháp phòng bệnh Vibrio trong sản xuất giống nhân tạo tôm thẻ chân trắng
Xác ựịnh số
lượng Vibrio ở
hậu ấu trùng (PL) Tình hình sản xuất, dịch bệnh trên
tôm bố mẹ và tôm giống tại cơ sở
mẹ, các bệnh thường gặp trong sản xuất giống, nguồn nước cấp và xử lắ thải, việc sử
dụng thuốc, hóa chất, chế phẩm sinh học, thức ăn và khâu vệ sinh trong hệ thống sản xuất tôm giống. Ngoài ra, còn sử dụng phương pháp ựiều tra hồi cứu ựể phục vụ cho những phân tắch và nhận ựịnh các yếu tố cơ bản nhằm xác ựịnh nguyên nhân lây nhiễm
Vibrio trong trong sản xuất giống tôm chân trắng tại Ninh Hải-Ninh Thuận...). Tổng số
phiếu ựiều tra 44 trại sản xuất tôm giống.
+ Phương pháp thu mẫu ựể phân tắch, ựánh giá nguyên nhân lây nhiễm:
- Thu mẫu phân tắch một số tác nhân vi khuẩn có khả năng gây bệnh trên tôm giống. Số lượng mẫu thu 30 mẫu từ 10 cơ sở sản xuất giống tôm thẻ chân trắng.
- Thu mẫu nước cấp và nước ựã xử lắ ựể cho vào hệ thống sản xuất tôm giống: 30 mẫu từ 10 cơ sở sản xuất giống.
- Thu mẫu nước thải ựã qua sử dụng trong hệ thống sản xuất tôm giống: Thu 10 trại cho sản xuất, mỗi trại thu 3 mẫu (30 mẫu).
- Thu mẫu tôm và mẫu nước nuôi giai ựoạn hậu ấu trùng tôm chân trắng trong quá trình sản xuất giống, thu 3 mẫu cho mỗi trại. Tổng số trại giống thu mẫu là 10 trại. - Thu mẫu tôm và mẫu nước nuôi ở những trại có bể nuôi bị sự cố (chết) ựể làm
ựối chứng so sánh: 10 trại, mỗi trại thu 3 mẫu PL/trại.
- Thu mẫu chế phẩm sinh học sử dụng trong sản xuất tôm giống: 10 loại, mỗi loại 3 mẫu (30 mẫu) ựể phân tắch.
- Thu mẫu thức ăn sử dụng trong quá trình sản xuất tôm giống: 10 loại, mỗi loại 3 mẫu (30 mẫu) ựể phân tắch.
- Thu mẫu từ các dụng cụ sử dụng trong quá trình sản xuất tôm giống: Thu 3 mẫu mỗi loại dụng cụ (vợt Nauplii, vợt Zoae, vợt Mysis, vợt PL, dây sục khắ, ca nhựa, xô nhựa) ựể phân tắch.
Các mẫu tôm thu ựể xác ựịnh nguyên nhân lây nhiễm ựược thu mẫu sống. Các mẫu thức ăn, mẫu chế phẩm sinh học, mẫu nước, sử dụng trong quá trình sản xuất tôm giống ựược bảo quản trong thùng lạnh (6oC). Ghi chép lý lịch ngày thu mẫu, ựịa phương thu và phương pháp thu mẫu tôm.
+ Phương pháp phân tắch, ựánh giá nguyên nhân lây nhiễm:
- Chỉ tiêu phân tắch: Mẫu ựược tiến hành phân tắch ựịnh lượng nhóm vi khuẩn
Vibrio theo phương pháp thể hiện ở mục 2.3.3.1
- Phương pháp phân tắch, ựánh giá nguyên nhân lây nhiễm: Từ các kết quảựiều tra, ựịnh lượng nhóm vi khuẩn Vibrioở các mẫu thu so sánh với sự nhiễm khuẩn ở tôm từựó ựánh giá sự lây nhiễm.
2.3.1.2. đề xuất một số giải pháp kiểm soát Vibrio trong sản xuất giống tôm chân trắng
Dựa vào kết quảựiều tra nguyên nhân lây nhiễm ựề ra giải pháp kiểm soát Vibrio
trong sản xuất giống tôm chân trắng tại Ninh Hải - Ninh Thuận.
2.3.2. Xác ựịnh mức ựộ và ngưỡng gây bệnh của nhóm Vibrio trên tôm chân trắng giống ở các nồng ựộ khác nhau bằng phương pháp gây nhiễm thực nghiệm
* Xác ựịnh sự hiện diện và số lượng của nhóm Vibrio nhiễm ở hậu ấu trùng (PL) tôm chân trắng
+ Thu mẫu tôm và mẫu nước nuôi bao gồm 30 mẫu PL tôm chân trắng từ 10 trại sản xuất giống khác nhau
+ Thu mẫu mẫu tôm và mẫu nước nuôi ở những trại có bể nuôi bị sự cố (chết) ựể
làm ựối chứng so sánh: 10 trại, mỗi trại thu 3 mẫu PL.
+ Xác ựịnh sự hiện diện và số lượng của nhóm Vibrio bội nhiễm trong tôm chân trắng PL nuôi bằng nuôi cấy, phân lập trên môi trường không chọn lọc (TSA), chọn lọc (TCBS), tăng sinh trên môi trường (TSB) theo phương pháp gián tiếp của Koch (mục 2.3.3.1).
+ định danh Vibrio theo hệ thống phân loại BergeyỖs (1994) kết hợp với kắt API 20 NE (Bio Merieux, Pháp)
+ định lượng Vibrio theo phương pháp trang vi khuẩn trên ựĩa môi trường TCBS của Koch.
+ Sử dụng kỹ thuật mô bệnh học cho giáp xác của Lightner (1996) ựể quan sát những biến ựổi bên trong mô tế bào tôm PL (hình 2.4).
* Các thắ nghiệm triển khai:
Thắ nghiệm ựược tiến hành trên 3 chủng Vibrio: Vibrio alginolyticus, V. parahaemolyticus và V. vulnificus (3 loài thường bắt gặp kắ sinh nhiều trên hậu ấu trùng tôm sú, tôm thẻ chân trắng) ở bể kắnh có thể tắch 10 lắt, với nhiệt ựộ 28oC, pH = 8,1, ựộ mặn 34 0/00. Thắ nghiệm ựược lặp lại 3 lần theo sơựồ hình 2.3.
Hình 2.3. Sơ ựồ bố trắ thắ nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn Vibrio trên PL tôm thẻ chân trắng
Ghi chú:
đC: đối chứng, không cảm nhiễm tất cả các vi khuẩn ựem thắ nghiệm
TN1: Cảm nhiễm Vibrio alginolyticus (V. algi) với các nồng ựộ: 5x101, 5x102, 5x103, 5x104, 5x105cfu/ml
TN2: Cảm nhiễm V. parahaemolyticus (V. para) với các nồng ựộ: 5x101, 5x102, 5x103, 5x104, 5x105cfu/ml
TN3: Cảm nhiễm V.vulnificus(V. vulni) với các nồng ựộ: 5x101, 5x102, 5x103, 5x104, 5x105cfu/ml
TN4: Cảm nhiễm V. algi + V. para với các nồng ựộ: 5x101, 5x102, 5x103, 5x104, 5x105cfu/ml (Tỷ lệ 1:1)
TN5: Cảm nhiễm V. algi +V.vulni với các nồng ựộ: 5x101, 5x102, 5x103, 5x104, 5x105cfu/ml (Tỷ lệ 1:1)
TN6: Cảm nhiễm V. para + V. vulni với các nồng ựộ: 5x101, 5x102, 5x103, 5x104, 5x105cfu/ml (Tỷ lệ 1:1)
TN7: Cảm nhiễm V. algi +V. para + V. vulni với các nồng ựộ: 5x101, 5x102, 5x103, 5x104, 5x105cfu/ml (Tỷ lệ 1:1:1)
Ớ Chuẩn bị chủng thắ nghiệm:
Chủng vi khuẩn gây cảm nhiễm ựược phục hồi trên môi trường lỏng TSB và giữ
trong tủ ấm 24 giờ ở 280C, sau ựó cấy ria ựể chọn một khuẩn lạc ựơn tăng sinh trong môi trường lỏng TSA trong 24 giờ, xác ựịnh mật ựộ vi khuẩn bằng máy so màu quang
Tôm PL khỏe thẻ chân trắng Chủng vi khuẩn thắ nghiệm
đC 400 PL khỏe TN1 400 PL + V. algi TN2 400 PL + V. para TN4 400 PL + V. algi + V. para TN3 400 PL + V. vulni TN5 400 PL + V. algi +V.vulni
- Theo dõi các yếu tố môi trường (pH, nhiệt ựộ, ựộ mặn)
- Tỷ lệ chết của tôm, kiểm tra sự nhiễm khuẩn ở tôm ựịnh kỳ 12 giờ/lần - đánh giá mức ựộ gây bệnh của vi khuẩn thắ nghiệm ựối với tôm.
TN6 400 PL + V. para+ V. vulni TN7 400 PL + V. algi + V. para+ V. vulni
phổ (Spectro 2000, Labomed, Inc.) ở bước sóng 600 nm. Sau ựó pha loãng theo hệ số
10 ựểựạt ựược nồng ựộ thắ nghiệm. Ớ Các chỉ tiêu theo dõi:
Kiểm tra các yếu tố thủy hóa chắnh (pH, nhiệt ựộ, ựộ mặn) trong quá trình gây nhiễm ựể thắch hợp cho tôm. Theo dõi tỷ lệ chết của tôm và kiểm tra sự nhiễm khuẩn ở
tôm 12 giờ/lần.
Thắ nghiệm ựược tiến hành trên 3 chủng Vibrio: V. alginolyticus, V. parahaemolyticus
và V. vulnificus (3 loài thường bắt gặp nhiều trên hậu ấu trùng tôm thẻ chân trắng) thắ nghiệm ựược lặp lại 3 lần theo sơ ựồ hình 2.3
2.3.3. Một số phương pháp phân tắch sử dụng trong ựề tài
2.3.3.1. Phương pháp phân tắch các tác nhân sinh học * Phương pháp kiểm tra nhanh
- Làm các tiêu bản giọt ép: Áp dụng theo Nguyễn Lân Dũng và cộng sự [3].
- Làm các tiêu bản phếch: Từ mô gan tụy tôm bệnh và tôm khỏe, phếch lên lam kắnh sạch và tiến hành nhuộm với các loại thuốc nhuộm khác nhau: Gram; Hematoxylin và Eosin; Pinkerton; Giemsa ựể phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn ký sinh nội bào hay các vi khuẩn ký sinh trong nguyên sinh chất của gan tụy tôm.
* Phương pháp xác ựịnh LD50
Áp dụng phương pháp Reed và Muench (1938)
Bố trắ thắ nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn lên Postlarva tôm khỏe với các nghiệm thức: Nghiệm thức ựối chứng, nghiệm thức thắ nghiệm ựược cảm nhiễm với các nồng
ựộ vi khuẩn: 5x101, 5x102, 5x103, 5x104, 5x105cfu/ml. Nồng ựộ gây chết 50% tôm Postlarva của vi khuẩn ựược xác ựịnh sau 24h cảm nhiễm và ựược tắnh theo công thức:
LogLD50 = LogA + x Log10 Trong ựó:
LogA: Nồng ựộ vi khuẩn gây tỷ lệ chết Postlarvae dưới và cận 50%
d%: Tỷ lệ chết Postlarvae dưới 50% cao nhất
t%: Tỷ lệ chết Postlarvae trên 50% thấp nhất
Log10: ựộ pha loãng
* Phương pháp nghiên cứu mầm bệnh vi khuẩn nuôi cấy ựược
Dựa trên phương pháp nghiên cứu bệnh vi khuẩn của Frerich (1984) và Kimberley (2004), thực hiện phân lập các chủng vi khuẩn hiện diện trong các mô gan tụy của tôm bệnh. Quy trình phân lập vi khuẩn ựược thực hiện theo hình 2.5
- Vi khuẩn hiếu khắ tổng số và vibrio tổng số trong mẫu nước: Theo phương pháp gián tiếp của Koch
Hình 2.4: Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
2.3.3.2. Phương pháp phân tắch các chỉ tiêu chất lượng nước
- Nhiệt ựộ nước (T0C): đo bằng nhiệt kế thủy ngân (00C-1000C). - độ pH: đo bằng pH meter cầm tay.
- độ muối (S0/00): Xác ựịnh bằng khúc xạ kế (refractometor) - DO: đo bằng phương pháp winkler
- BOD: Phương pháp tắnh gia số oxy sau 5 ngày ủ mẫu.
2.4. Phương pháp xử lý và phân tắch số liệu
Sử dụng phương pháp thống kê mô tảựể xử lý thông tin, ựánh giá các yếu tốảnh hưởng ựến nguồn lây nhiễm Vibrio trong trại sản xuất giống.
Sử dụng phần mềm Excel 7.0 ựể xử lý các số liệu thu thập ựược trong quá trình nghiên cứu - Xác ựịnh tỷ lệ sống NA TCBS BH Nuôi cấy trực tiếp Làm các loại tiêu bản Thực hiện các phản ứng sinh hóa Giọt ép, treo, nhuộm Gram Nuôi cấy tăng sinh Giải phẫu gan tụy Thu chủng VK thuần Mẫu tôm bệnh và tôm khoẻ
Xác ựịnh tên vi khuẩn theo khóa phân loại của Bergey, 1994
Nuôi cấy phân lập
Số lượng tôm thu
Tỷ lệ sống của tôm (%) = x 100
CHƯƠNG 3:
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả xác ựịnh nguồn lây nhiễm và ựề xuất các giải pháp kiểm soát Vibrio
trong sản xuất giống tôm chân trắng tại Ninh Hải-Ninh Thuận
3.1.1. Kết quả ựiều tra tình hình sản xuất, dịch bệnh trên tôm bố mẹ và tôm giống tại Ninh Hải-Ninh Thuận và thu mẫu phân tắch một số loài Vibrio có khả năng gây tại Ninh Hải-Ninh Thuận và thu mẫu phân tắch một số loài Vibrio có khả năng gây bệnh trên tôm giống
Kết quả ựiều tra tình hình sản xuất giống, dịch bệnh trên tôm bố mẹ cho thấy có 60% số trại sản xuất giống cho biết là người mua tôm giống tại trại phản ánh có hiện tượng tôm bị chết sớm (30-40% số người mua). Trong số này bắt gặp ở cả các công ty lớn và ở cả các trại sản xuất nhỏ. Các trại giống có hệ thống xử lý nước, áp dụng các biện pháp kỹ thuật, sử dụng các loại hóa chất, chế phẩm sinh học khác nhau nhưng tôm giống bán ra khi nuôi vẫn có khả năng bị bệnh.
Tôm giống từ các khu vực sản xuất khác nhau, nguồn gốc tôm bố mẹ khác nhau khi nuôi vẫn bị bệnh hội chứng gan tụy cấp.
Hình 3.1: Tỷ lệ (%) một số bệnh thường gặp trong sản xuất giống tôm thẻ chân trắng tại Ninh Hải-Ninh Thuận
Trong quá trình sản xuất chưa phát hiện tôm giống bị bệnh như tôm thương phẩm. Các bệnh thường gặp trong sản xuất giống tôm là: bệnh ựường ruột, phát sáng,
Tỷ
lệ
%
ựục thân, xù ựầu, dắnh chân, nấm và nhầy. Trong các bệnh này thì nấm là bệnh thường gặp có tỷ lệ trung bình cao nhất (hình 3.1).
Theo các cơ sở sản xuất thì tôm bố mẹ trước khi ựưa vào sản xuất ựã ựược kiểm tra rất kỹ và ựược sự cho phép của các cơ quan thú y quản lý. Tôm bố mẹ sau khi nhập về ựược lấy mẫu xét nghiệm các bệnh thường gặp và ựược theo dõi 1 tuần nếu không bị bệnh mới ựược cấp phép và ựưa vào sản xuất giống. Không có trại sản xuất nào cho biết là tôm bố mẹ có hiện tượng bị chết tương tự như tôm nuôi thương phẩm mắc bệnh gan tụy. Có 3% số trại cho biết có tôm bố mẹ chết rải rác nhưng không rõ nguyên nhân.
3.1.2. Kết quả khảo sát quá trình xử lý nước, nguồn thức ăn, vệ sinh hệ thống sản xuất, sử dụng hóa chất và chế phẩm sinh học nhằm xác ựịnh nguyên nhân lây xuất, sử dụng hóa chất và chế phẩm sinh học nhằm xác ựịnh nguyên nhân lây nhiễm Vibrio trong sản xuất giống tôm thẻ chân trắng
3.1.2.1. Kết quả khảo sát quy trình xử lý nước, việc xử lý nước và kiểm tra Vibrio trong nước ở các trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng
Kết quả khảo sát cho thấy quy trình xử lý nước ở các trại sản xuất tôm giống
ựược thể hiện ở hình 3.3
Hình 3.2: Sơựồ quy trình xử lắ nước tại các trại sản xuất giống tôm chân trắng tại Ninh Hải-Ninh Thuận
A: Quy trình xử lý nước chỉ sử dụng hóa chất không sử dụng chế phẩm sinh học; B: Quy trình xử lý nước sử dụng hóa chất kết hợp với chế phẩm sinh học.
điều chỉnh môi trường Nước biển Bể lọc Bể chứa Bể lọc Bể nuôi A Nước biển lBể ắng Hóa chất diệt khuẩn Bể lọc thô Chế phẩm sinh học Bể lọc tinh Bể chứa B ể nuôi B
Quy trình xử lý nước trong các trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng tại Ninh Hải- Ninh Thuận cho kết quả khá hiệu quả trong việc ngăn chặn sự lây lan nhiễm khuẩn Vibrio trong quá trình sản xuất giống. Hiệu quả này cao hơn ựối với các trại có xử dụng chế phẩm sinh học trong quy trình xử lý nước trước khi ựưa vào sản xuất giống.
Kết quảựiều tra về xử lý nước trong quá trình sản xuất giống tôm thẻ chân trắng cho thấy xử lý nước là khâu rất quan trọng trong quá trình sản xuất giống vì thế khâu này ựược quản lý rất chặt chẽ từ khâu bơm nước vào ựến giải quyết nguồn nước thải sau khi ương nuôi. Hệ thống bể lọc, bể nuôi vỗ, bể ựẻ, bể ương nuôi ấu trùng,... ựều
ựược che chắn, sục khắ ựảm bảo chất lượng kỹ thuật. Có 100% các trại giống ựều xử lý nguồn nước trước khi ựưa vào nuôi tôm bố mẹ và ương nuôi ấu trùng, tuy nhiên hầu