Chuẩn bị dịch chiết tỏi 20%
Pha dung dịch kháng sinh gốc ở nồng độ tiêu chuẩn là 200µg/ml.
Lấy 30 gam tép tỏi tƣơi đã lột vỏ ngoài và rửa sạch với nƣớc cất vô trùng. Sau đó xay nhuyễn. Cho nƣớc cất vô trùng vào vừa đủ 150 ml ta đƣợc dịch chiết tỏi 20%. Sau đó lọc qua giấy lọc Whatman với đƣờng kính lỗ lọc 2 µm, ta đƣợc dịch chiết tỏi cần dùng.
Pha dung dịch chuẩn độ đục MacFarland 0.5
Độ đục chuẩn MacFarland 0,5 đƣợc sử dụng để điều chỉnh độ đục của huyền dịch nuôi cấy vi khuẩn cho thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh.
Pha 100 ml dung dịch BaCl2 1,175 % (cân 1,175 gam BaCl2.2H2O pha với 100 ml nƣớc cất).
Pha 100 ml dung dịch H2S04 1% (hút 1 ml dung dịch H2S04 đậm đặc pha với 100 ml nƣớc cất). Hút 0,5 ml dung dịch BaCl2 1,175 % cho vào 99,5 ml dung dịch
100 ) 2 2 ' ( % X W P P W
21
H2S04 1% ta đƣợc 100 ml dung dịch chuẩn MacFarland 0,5 có độ đục tƣơng đƣơng nồng độ 108 CFU/ml.
Pha độ đục chuẩn dựa trên nguyên tắc phản ứng giữa: H2SO4 + BaCl → BaSO4↓+ HCl
Lắc đều trƣớc khi sử dụng để làm tan các hạt BaSO4 kết tủa trong tube.
Pha huyễn dịch vi khuẩn
Thử nghiệm xác định MIC thực hiện trên 10 giống vi khuẩn E.coli đƣợc phân lập từ gà thả vƣờn ở thành phố Cần Thơ. Các giống vi khuẩn đƣợc trữ ở -80o
C, trƣớc khi làm thử nghiệm, vi khuẩn E.coli đƣợc rã đông và cấy vào môi trƣờng thạch Na, ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ. Dùng que cấy vô trùng để lấy những khuẩn lạc hòa vào 9 ml dung dịch nƣớc muối sinh lý 0.9% vô trùng và trộn đều bằng máy trộn Voltex. Độ đục của hỗn dịch vi khuẩn sẽ đƣợc so sánh với độ đục chuẩn của ống MacFarland 0.5. Nếu hỗn dịch của vi khuẩn cùng độ đục với độ đục chuẩn của ống McFarland 0.5 thì ta đƣợc hỗn dịch vi khuẩn bằng 108 CFU/ml. Sau đó, pha loãng thành huyễn dịch vi khuẩn nồng độ 106 CFU/ml.
Tiến hành xác định MIC (Nguyễn Ngọc Hải, 2012)
Thử nghiệm thực hiện với nồng độ dịch chiết tỏi là 20% bằng phƣơng pháp pha loãng liên tiếp. Mỗi giống vi khuẩn E.coli thử nghiệm cần chuẩn bị 10 ống nghiệm vô trùng đánh số thứ tự từ 1 đến 10.
Dùng micropipette vô trùng hút 0,5 ml NB vô trùng phân phối lần lƣợt vào các ống nghiệm đƣợc đánh số từ 2 đến 10.
Tiếp theo hút 0,5 ml dịch chiết tỏi 20 % (200 µg/ml) đã chuẩn bị sẵn lần lƣợt cho vào ống nghiệm 1 và 2.
Dùng micropipet để pha loãng nồng độ kháng sinh từ ống số 2 đến ống số 9 bằng cách hút 0,5 ml hỗn dịch của dịch chiết tỏi và môi trƣờng từ ống số 2 sang ống số 3 và trộn đều. Tiếp tục nhƣ thế cho đến ống số 9. Hút 0,5 ml hỗn dịch của dịch chiết tỏi và môi trƣờng ở ống số 9 bỏ đi. Ống số 10 giữ nguyên (không có dịch chiết tỏi).
Dùng micropipet để phân phối 0,5 ml huyễn dịch vi khuẩn nồng độ 106 CFU/ml vào ống nghiệm từ số 1 đến số 10.
Lắc đều ống nghiệm 10 ống nghiệm vào tủ ấm ở nhiệt độ 37°C trong 16 - 20 giờ. Sau đó, đánh giá kết quả mọc của vi khuẩn trong ống nghiệm:
22
Các ống nghiệm từ 1 đến 9: tùy theo nồng độ dịch chiết tỏi có trong ống nghiệm mà độ đục của môi trƣờng (do vi khuẩn mọc) sẽ khác nhau.
Ghi nhận độ pha loãng dịch chiết tỏi cao nhất (ống nghiệm cuối cùng) mà ở đó vi khuẩn không mọc đƣợc để tính giá trị của MIC.
Giá trị của MIC đƣợc tính nhƣ sau: MIC (µg/ml) = A0 x d Trong đó :
A0: Nồng độ dịch chiết tỏi có trong dung dịch chiết tỏi đầu tiên (200µg/ml) d : Độ pha loãng dịch chiết cao nhất mà ở đó không có vi khuẩn mọc.
Bảng 3.1 Nồng độ dịch chiết tỏi pha loãng ở các ống nghiệm
Ống nghiệm Độ pha loãng Nồng độ dịch chiết tỏi (µg/ml)
1 1/2 100 2 1/4 50 3 1/8 25 4 1/16 12,5 5 1/32 6,25 6 1/64 3,125 7 1/128 1,562 8 1/256 0,781 9 1/512 0,390 10 - 0
Quy trình thực hiện phƣơng pháp pha loãng dịch chiết tỏi đƣợc mô tả ở hình 3.3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hình 3.2 Phƣơng pháp pha loãng dịch chiết tỏi
Hút bỏ 0,5ml NB 0,5ml NB 0,5ml NB 0,5ml NB 0,5ml NB 0,5ml NB 0,5ml NB 0,5ml NB 0,5ml NB 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5 Ống 6 Ống 7 Ống 8 Ống 9 Ống 10 0,5 ml 0,5 ml Trộn đều 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml Độ pha loãng 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 Nuôi cấy ở 370 C, 18 – 20 giờ và đọc kết quả. 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml Huyễn dịch Dịch chiết 0.5ml 1/2
23