2. Ứng dụng của chitin/chitosan và dẫn xuất
2.2.1.Điều chế chitin/chitosan
2.2.1.1. Điều chế chitin
- Chuẩn bị nguyên liệu: Mai mực ống phơi khô, loại bỏ tạp chất, bẻ nhỏ đến kích thước trung bình khoảng 2x2 cm.
-Loại muối khoáng và protein: Cân 1kg mai mực đã bẻ nhỏ cho vào 10 lit dung dịch HCl 1N, ngâm trong 48 giờ, sau đó rửa sạch bằng nước cất đến pH 7 thu được nguyên liệu đã tách khoáng. Ngâm nguyên liệu đã được tách khoáng trong dung dịch kiềm 10% trong 48 giờ, sau đó rửa sạch bằng nước cất đến pH 7. Lặp lại quá trình trên 2 lần để loại bỏ hết muối khoáng và protein. Phơi khô sản phẩm ở nhiệt độ phòng, sau đó sấy khô chân không ở
nhiệt độ 60oC đến khối lượng không đổi thu được chitin màu trắng, xốp, không tan trong nước.
Bảng 2.1: Thành phần chính của một số nguyên liệu chứa chitin Nguyên liệu Chitin (loại) (%) Muối khoáng
(%)
Protein (%)
Vỏ tôm khô 15 – 20 ( ) 40 – 50 30 – 40
Mai mực ống 30 – 40 ( ) Rất ít 60
Mai mực nang 1-2 (không xác định) Chủ yếu Ít - Hiệu suất tách chitin được tính theo công thức 2.1.
chitin(%) = nguyenlieu chitin m m x 100% {2.1}
Trong đó: chitin là hàm lượng chitin có trong mẫu nguyên liệu (%) mchitin là khối lượng sản phẩm chitin thu được (g)
mnguyên liệu là khối lượng nguyên liệu ban đầu.
2.2.1.2. Điều chế chitosan
- Điều chế chitosan theo phương pháp kiềm đặc kết hợp nhiệt độ cao:
Cân 35g chitin cho vào bình cầu đã chứa dung dịch NaOH 50% ở 100 120oC, khuấy trên máy khuấy từ liên tục trong 24 giờ. Lọc, rửa mẫu
nhiều lần bằng nước cất đền pH 7 thu được chitosan màu trắng, tan trong môi trường axit axetic 1%. Tiến hành phản ứng lặp lại để thu được chitosan có độ axetyl hóa thấp (DA < 10%).
O O HO NHCOCH3 OH n O O HO NH2 OH m dd NaOH, t0
chitosan thu được ở trên (theo phương pháp kiềm đặc kết hợp nhiệt độ cao) trong dung dịch axit axetic 1%, để qua đêm sau đó lọc bỏ phần không tan. Tiếp đó cho vào dung dịch chitosan này lượng NaOH rắn để đạt nồng độ 5% và tiến hành phản ứng đeaxetyl hóa ở 100oC trong khoảng thời gian 3 giờ. Sau khi phản ứng kết thúc, tiến hành lọc và rửa sản phẩm nhiều lần bằng nước cất cho đến pH 7 thu được chitosan sạch.
- Hiệu suất phản ứng đeaxetyl hóa được tính theo công thức {2.2}: G1 (%) =
o
m m
x 100 {2.2}
Trong đó: m là khối lượng sản phẩm phản ứng đeaxetyl hóa (g). mo là khối lượng của chitin ban đầu (g).
2.2.1.3. Xác định độ axetyl hóa/đeaxetyl hóa
- Dựa vào phổ IR độ axetyl hoá DA của chitin/chitosan được xác định theo công thức {2.3} của Robert:
115 3450 1655
A1655 là diện tích pic hấp thụ ở 1655 cm-1 (C=O) A3450 là diện tích pic hấp thụ ở 3450 cm-1 (OH) - Dựa vào phổ cộng hưởng từ hạt nhân, độ axetyl hóa của mẫu chitosan tính theo công thức {2.4}:
DA=ICH3/3(IH1 chitosan+IH1 chitin) x100% {2.4} (Trong đó I là giá trị tích phân của các pic tín hiệu)
2.2.1.4. Xác định khối lượng phân tử trung bình số của chitosan
Phương pháp đo áp suất thẩm thấu là phương pháp dựa trên định luật Vant - Hoff. Theo định luật này, sự phụ thuộc giữa áp suất thẩm thấu P, thể tích V, nhiệt độ tuyệt đối T và số gam phân tử của vật chất trong dung dịch pha loãng được biểu diễn bằng phương trình trùng với dạng phương trình của dạng khí lý tưởng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khối lượng phân tử trung bình của chitosan được xác định như sau: Pha dung dịch chitosan có nồng độ lần lựơt: 0,025; 0,05; 0,1; 0,2; 0,4(g/100ml) trong dung môi axit axetic 1% ở nhiệt độ 35oC. Lập bảng giá trị sự phụ thuộc của áp suất thẩm thấu () vào nồng độ (C), xây dựng đường biểu diễn sự phụ thuộc của /C vào C để tìm giá trị ngoại suy của /C khi C→0. Thay vào phương trình {2.5} để tính toán được khối lượng phân tử trung bình số.
n = 0 848.( 273) ( ). C T dm D C {2.5}
Trong đó: : áp suất thẩm thấu
n
: khối lượng phân tử trung bình số 848: hằng số
T: nhiệt độ đo C: nồng độ chitosan
/C (C→0): giá trị ngoại suy của /C khi C→0. Ddm: tỷ trọng của dung môi
2.2.2. Điều chế dẫn xuất chitosan - glutaralđehyt
2.2.2.1. Chuẩn bị các dung dịch
* Hòa tan 0,5g chitosan trong 45ml dung dịch axit axetic 1% - metanol (tỉ lệ 1:2 v/v). Khuấy trên máy khuấy từ trong 24h cho đến khi chitosan tan hoàn toàn. Ly tâm để loại bỏ phần không tan.
* Phân tán glutaralđehyt trong metanol (tỉ lệ 1:10).
- Tiến hành: Thêm dần dần 100 ml glutaralđehyt nồng độ khác nhau (từ 0,0 đến 0,25 mol/lit) vào dung dịch chitosan, vừa nhỏ vừa tiến hành khuấy mạnh hỗn hợp. Tiến hành phản ứng trong các khoảng thời gian nhất định tại các nồng độ glutaralđehyt xác định. Sản phẩm phản ứng thu được ở dạng gel được trung hòa về pH 6÷7, nghiền nhỏ, ngâm rửa hoặc soxlet nhiều lần bằng
hỗn hợp nước, metanol và axeton để đảm bảo không còn glutaralđehyt dư trong sản phẩm (thực nghiệm cho thấy, chỉ cần 35 lần rửa với lượng dung môi 300500 ml là có thể loại bỏ hoàn toàn glutaralđehyt đủ). Rửa lại sản phẩm bằng nước cất cho đến trung tính và sấy khô chân không ở nhiệt độ 70oC đến khối lượng không đổi. Bảo quản mẫu trong bình hút ẩm ở nhiệt độ phòng.
2.2.2.2. Khảo sát phản ứng với điều kiện thí nghiệm khác nhau.
Nồng độ glutaralđehyt lần lượt là 0÷0,15 mol/lit (các mẫu ký hiệu lần lượt là CG00,1, CG00,5, CG1,CG5,CG010,CG015) trong 12 giờ, tại nhiệt độ 30oC.
Nhiệt độ phản ứng: 30, 40, 55oC
Thời gian phản ứng lần lượt là: 6, 12, 24 giờ
Ảnh hưởng của khối lượng phân tử trung bình: Tiến hành phản ứng lần lượt glutaralđehyt với chitosan có khối lượng phân tử trung bình khác nhau: 410 KDa; 200 KDa và 105 KDa 12 giờ.
Hiệu suất phản ứng được tính theo công thức {2.6} H (%) =
o
m m1
x 100 { 2.6 }
Trong đó: H là hiệu suất ghép.
mo là khối lượng của dẫn xuất thu được theo lý thuyết (g). m1 là khối lượng dẫn xuất thực tế thu đuợc (g).
2.2.3. Khảo sát khả năng hấp phụ ion kim loại của chitosan và dẫn xuất
Quy trình thực hiện hấp phụ ion kim loại lên chitosan và dẫn xuất như sau: Cân 50mg dẫn xuất vào bình tam giác 100ml, thêm tiếp vào bình 50ml dung dịch muối của ion kim loại ở các nồng độ nhất định. Hỗn hợp được lắc bằng máy lắc ở nhiệt độ 30oC trong những khoảng thời gian cần khảo sát. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 15000 vòng/phút, phần cặn được sấy khô chân không
trong tủ sấy ở 60oC đến khối lượng không đổi, phần nước được đo trên máy hấp thụ nguyên tử (ASS) để xác định nồng độ ion kim loại còn lại. Khả năng hấp phụ ion kim loại lên các sảp phẩm được xác định theo công thức {2.8}.
Q1 = ( ) w o V C C {2.8} Trong đó:
Q1 là khả năng hấp phụ (mmol ion kim loại/g chất hấp phụ) V thể tích dung dịch hấp phụ (l)
Co nồng độ ion kim loại trong dung dịch ban đầu (mmol/l) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C là nồng độ ion kim loại trong dung dịch nước sau khi hấp phụ (mmol/l).
W là khối lượng chất hấp phụ (g).
2.2.4. Giải hấp phụ, tái hấp phụ - Quy trình hấp phụ - giải hấp phụ
2.2.4.1. Giải hấp phụ
Cân 50 mg dẫn xuất chitosan – glutaralđehyt đã hấp phụ ion kim loại cho vào bình tam giác 50 ml đã chứa 25 ml dung dịch HCl 0,1N (pH = 1). Hỗn hợp được khuấy trong 8 giờ ở nhiệt độ phòng, sau đó ly tâm với tốc độ 15000 vòng/phút. Phần cặn đem sấy khô chân không ở 60oC, phần nước đem xác định nồng độ ion kim loại bằng AAS. Khả năng giải hấp phụ ion kim loại khỏi chất hấp phụ được tính theo phần trăm tỷ số của khối lượng ion kim loại trong nước lọc và khối lượng ion kim loại đã hấp phụ lên polyme.
2.2.4.2. Tái hấp phụ ion kim loại – chu trình hấp phụ - giải hấp phụ
- Lặp lại quá trình giải hấp phụ ion kim loại khỏi chất hấp phụ (pH=1) cho tới khi không xác định được sự có mặt của ion kim loại trong nước lọc.
- Sấy khô chân không polyme ở 60oC đến khối lượng không đổi. Sau đó, tiến hành tái hấp phụ ion kim loại lên chitosan và dẫn xuất như quá trình hấp phụ.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Điều chế chitin/chitosan 3.1.1. Điều chế chitin 3.1.1. Điều chế chitin
β-chitin được tách từ mai mực theo quy trình thực nghiệm 2.2.1.1 có màu trắng, xốp, không tan trong nước. Hàm lượng β-chitin chiếm ≈ 37,5% (bảng 3.1). Kết quả này phù hợp với số liệu được công bố: hàm lượng chitin trong mai mực ống từ 30 - 40% [1], [2], [4]
Bảng 3.1: Hàm lượng β-chitin trong mai mực ống Mẫu m1 (khối lượng
mai mực ống) m2 (khối lượng chitin) δ = (m2/m1)x100% M1 1 kg 378 ≈ 37,5% M2 1 kg 372 M3 1 kg 375
Phổ hồng ngoại của chitin được thể hiện ở hình 3.1
Hình 3.1: Phổ hồng ngoại của β-chitin
Từ hình 3.1 có thể quy kết các pic phổ đặc trưng như sau: Vùng 3100 3600cm-1 đặc trưng cho dao động hoá trị của nhóm hydroxyl (-OH), 2871cm-1
đặc trưng cho dao động hoá trị của liên kết CH (C–H ); 1655 cm-1 đặc trưng cho dao động hoá trị của nhóm cacbonyl C=O (của amit I); 1560 cm-1 đặc trưng cho dao động biến dạng của liên kết N-H (N-H) (amit II); 1393 cm-1 là đặc trưng cho dao động biến dạng của CH3 (symetrical angular defomation), 1071cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của C-O-C trong liên kết (14) glucozit. DA của chitin tính được theo công thức 2.3 là 78%.
3.1.2. Điều chế chitosan từ chitin theo phương pháp kiềm đặc kết hợp nhiệt độ cao. nhiệt độ cao.
Phản ứng đeaxetyl hóa chitin trong môi trường kiềm thực chất là phản ứng thủy phân nhóm axetamit. Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ 120oC, nồng độ NaOH 50%, thời gian 24 giờ.
O NH2 OH HO O O NHAc OH HO O O NHAc OH HO O y OH- n x
Sơ đồ 1.20: Phản ứng đeaxetyl hóa chitin
Hiệu suất phản ứng đeaxetyl hóa tính theo công thức {2.2} phần thực nghiệm: G1% = 26g/37,5g ≈ 70%. Như vậy, hiệu suất phản ứng đeaxetyl hóa là khá cao.
Chitosan thu được từ phản ứng đeaxetyl hóa chitin có dạng màu trắng, xốp, tan tốt trong môi trường axit loãng như axit axetic 1%.
3.1.2.1. Phổ hồng ngoại
Có thể nhận thấy rằng, phổ đồ của chitosan thu được không thay đổi nhiều so với β-chitin (hình 3.2). Các tín hiệu đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết O-H và liên kết C-H hầu như không đổi. Sự giảm cường độ pic 1654,4 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết C=O của nhóm amit và sự xuất hiện pic tại 1651 cm-1 đặc trưng cho dao động biến dạng của liên kết N-H (của nhóm NH
Hình 3.2: Phổ hồng ngoại của -chitosan
Dựa trên phổ IR, từ công thức {2.3} phần thực nghiệm tính được: DA% = 3450 1655 A A x 115= 0,065 0, 284x115≈ 23%. 3.1.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Từ phổ 1-NMR của chitosan thu được ở trên (hình 3.3), với công thức của chitosan (DA≠0%):
m O O HO NH2 OH O O HO NHCOCH3 OH n 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 Chitosan Chitin (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các pic đặc trưng có thể được quy kết như trong bảng 3.2:
Bảng 3.2: Độ chuyển dịch hoá học của proton (1H) của chitosan
Tín hiệu ppm Tín hiệu Ppm
H1(chitosan) 5,32 H5 4.20
H1(chitin) 5.05 H6a 4.33
H2 (chitin & chitosan) 3,65 H6b 4.47
H3 4,35 COCH3 (chitin) 2,50
Hình 3.3: Phổ 1-NMR của β-chitosan
Độ axetyl hoá của chitosan tính theo công thức: DA=ICH3/3(IH1 chitosan+IH1 chitin)100% (I là giá trị tích phân của các pic tín hiệu) là 28% (hay DDA=72%).
3.1.2.3. Phổ X-Ray
Phổ X-ray của chitosan điều chế từ mai mực ống (hình 3.4) cho thấy đỉnh nhiễu xạ ở vị trí góc 2 8,8 và 20 Ao. Kết quả này phù hợp với các công bố về đặc tính kết tinh của -chitosan.
3.1.2.4. Khối lượng phân tử
Kết quả đo áp suất thẩm thấu của dung dịch tại các nồng độ khác nhau được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3: Kết quả đo áp suất thẩm thấu của chitosan
tại các nồng độ khác nhau Tên mẫu C (g/100 ml) dn (kết quả trung bình 3 lần đo) (cm) /C Mẫu 1 0,025 30 0,314 12,58 Mẫu 2 0,05 98 1,027 20,547 Mẫu 3 0,1 341,6 3,582 35,817 Mẫu 4 0,2 1225 12,842 64,209 Mẫu 5 0,4 47,05 49,327 123,317
Vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ của C và /C (hình 3.10) để tìm giá trị ngoại suy của /C khi C0. Thay các giá trị vào công thức 2.5, khối lượng phân tử trung bình của chitosan điều chế được là: 45594 g/mol tương đương với 453 KDa, khối lượng phân tử của chitin/chitosan nằm trong khoảng 50÷2000 KDa.
3.1.3. Điều chế chitosan có DA thấp
3.1.3.1. Phổ hồng ngoại
Hình 3.6: Phổ FT - IR của -chitosan theo phương pháp phá kết tinh
Từ phổ hồng ngoại (hình 3.6) của chitosan thu được từ phản ứng deaxetyl hóa một lần chitosan thu được ở mục 3.1.2 trong dung dịch NaOH 5% theo phương pháp phá kết tinh (hình 3.6) cho thấy cường độ pic hấp thụ đặc trưng cho dao động hoá trị liên kết C=O của nhóm axetamit giảm mạnh, đồng thời xuất hiện píc hấp thụ tại 1603 cm-1 đặc trưng cho dao động biến dạng của liên kết N-H.
Theo công thức 2.3 phần thực nghiệm, -chitosan nhận được có DA 0 % (hay DDA100%), phản ứng deaxetyl hoá gần như diễn ra hoàn toàn.
3.1.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Kết quả ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân: phổ 1H-NMR; phổ 13C-NMR của mẫu chitosan thu được từ phản ứng deaxetyl hoá theo phương pháp phá kết tinh, trong dung môi D2O - 1% CF3COOD ở 800C được thể hiện trên các hình 3.7, 3.8, các pic tín hiệu có thể được quy kết như trong bảng 3.4 và 3.5.
Hình 3.7: Phổ 1H-NMR của –chitosan deaxetyl hoá hoàn toàn
Bảng 3.4: Độ chuyển dịch hóa học của proton (1H) của chitosan
Tín hiệu ppm Tín hiệu ppm H1 5,33 H5 4,24 H2 3,63 H6a 4,30 H3 4,37 H6b 4,46 H4 4,39 CH3 (của OCOCH3 tự do và trong mắt xích CTS) 2,55 và 2,57
Bảng 3.5: Độ dịch chuyển hóa học cacbon (13C) của Chitosan
Tín hiệu ppm Tín hiệu ppm
C1 99,7 C5 75,9
C2 57,2 C6 61,5 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C3 72,1 CH3 Không xuất hiện
C4 78,6 C=O Không xuất hiện
Từ các giá trị tích phân trên phổ 1H-NMR, độ axetyl hóa của chitosan tính theo công thức: DA=ICH3/3(IH1 chitosan+IH1 chitin)x100% (trong đó I là giá trị tích phân của pic tín hiệu) là 0% (hay DDA100%). Như vậy, sử dụng phương pháp phá kết tinh có thể điều chế chitosan có DA0%.
3.1.3.3. Giản đồ nhiễu xạ tia X
Kết quả chụp giản đồ nhiễu xạ tia X (hình 3.9) cho thấy chitosan điều chế được theo phương pháp phá kết tinh có độ kết tinh rất thấp.
Hình 3.9: Giản đồ nhiễu xạ tia X của chitosan điều chế theo
3.1.3.4. Khối lượng phân tử
Kết quả đo áp suất thẩm thấu () của chitosan điều chế theo phương pháp phá kết tinh được trình bày ở bảng 3.6. Khối lượng phân tử chitosan tính được: Mn = 41326 g/mol tương đương với 410 kDa. Như vậy, phản ứng cắt mạch giảm khối lượng phân tử diễn ra song song với phản ứng deaxetyl hóa chitosan.
Bảng 3.6: Kết quả đo áp suất thẩm thấu của chitosan DA0 Tên mẫu C(g/100ml) dn (trung bình 3 lần đo) (cm) /C M1 0,025 25,76 0,27 10,8 M2 0,05 89,22 0,935 18,70 M3 0,1 318,6 3,050 30,5 M4 0,2 291,1 11,46 57,3 M5 0,4 3912 41,00 102,5 y = 242.19x + 6.3208 0 20 40 60 80 100 120 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 C /C
Nhận xét 1:
+ Đã tách được chitin từ mai mực ống, hàm lượng chitin khoảng 37,5%