- Xã Nga Tân, huyện Nga Sơn, tỉnhThanh Hóa.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp nghiên cứu ngoài đồng ruộng
Chúng tôi áp dụng điều tra theo tài liệu “Phương pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật” của Viện Bảo vệ Thực vật (1997) và theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01 - 38:2010/BNNPTNT
Trong quá trình làm đề tài nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện điều tra thành phần bệnh hại, tình hình phát sinh một số bệnh nấm hại cói trên đồng ruộng tại mô hình bón phân viên nén chậm tan và trên cói trồng ở trong đê biển và ngoài đê biển tại xã Nga Tân, huyện Nga Sơn, tỉnh Thanh Hóa vụ chiêm năm 2014.
3.4.1.1. Phương pháp điều tra thành phần bệnh hại
Điều tra theo phương pháp 5 điểm chéo góc, mỗi điểm điều tra 0,25m2. Khi điều tra tiến hành thu thập tất cả các mẫu bệnh hại để phân lập, giám định vi sinh vật gây hại.
3.4.1.2. Phương pháp điều tra tình hình bệnh nấm hại trên mô hình bón phân viên nén chậm tan
Tại mô hình bón phân viên nén chậm tan thì có 3 mức bón phân và mỗi mức bón lại bón theo 2 cách khác nhau được chia theo tỷ lệ phân bón cho mỗi đợt bón thúc:
• Mức bón 1: Bón 120N + 60P2O5 + 70K2O. Lượng bón phân viên nén với 1ha là 700kg. Lượng bón cho 1 sào (500m2) là 56kg. Bón bù thêm 20,8kg super lân/sào:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32 phân viên nén chậm tan (bón 28kg/sào), lần 2 bón 50% số phân viên nén chậm tan (bón 28kg/sào) trước khi thu hoạch 45 ngày.
- CT2: Tỷ lệ bón 70 : 30. Hộ nông dân ứng dụng tỷ lệ bón: lần 1 bón 70%
số phân viên nén chậm tan (bón 40kg/sào), lần 2 bón 30% số phân viên nén chậm tan (bón 16kg/sào) trước khi thu hoạch 45 ngày.
• Mức bón 2: Bón 150N + 90P2O5 + 90K2O. Lượng bón phân viên nén với 1ha là 900kg. Lượng bón cho 1 sào (500m2) là 72kg. Bón bù thêm 20,8kg super lân/sào:
- CT3: Tỷ lệ bón 50 : 50. Hộ nông dân ứng dụng tỷ lệ bón: lần 1 bón 50%
số phân viên nén chậm tan (bón 36kg/sào), lần 2 bón 50% số phân viên nén chậm tan (bón 36kg/sào) trước khi thu hoạch 45 ngày.
- CT4: Tỷ lệ bón 70 : 30. Hộ nông dân ứng dụng tỷ lệ bón: lần 1 bón 70%
số phân viên nén chậm tan (bón 50kg/sào), lần 2 bón 30% số phân viên nén chậm tan (bón 22kg/sào) trước khi thu hoạch 45 ngày.
• Mức bón 3: Bón 170N + 90P2O5 + 100K2O. Lượng bón phân viên nén với 1ha là 1000kg. Lượng bón cho 1 sào (500m2) là 80kg. Bón bù thêm 20,8kg super lân/sào:
- CT5: Tỷ lệ bón 50 : 50. Hộ nông dân ứng dụng tỷ lệ bón: lần 1 là 50% số
phân viên nén chậm tan (bón 40kg/sào), lần 2 bón 50% số phân viên nén chậm tan (bón 40kg/sào) trước khi thu hoạch 45 ngày.
- CT6: Tỷ lệ bón 70 : 30. Hộ nông dân ứng dụng tỷ lệ bón: lần 1 bón 70%
số phân viên nén chậm tan (bón 56kg/sào), lần 2 bón 30% số phân viên nén chậm tan (bón 24kg/sào) trước khi thu hoạch 45 ngày.
- Công thức CT7 (ĐC) là công thức đối chứng trên ruộng sản xuất theo
phương thức truyền thống của nông dân. Ở ruộng này lượng phân bón mà người dân bón trong 1 sào (500m2) bao gồm 25kg phân NPK và 35kg đạm.
Thời gian bón phân đợt 1 vào ngày 25/03/2014 và lần thứ 2 vào ngày 25/04/2014 (trước khi thu hoạch cói 45 ngày). Lượng phân bón cho mỗi đợt dựa vào các tỷ lệ bón ở các công thức đã nói ở trên.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33 thực vật” của Viện Bảo vệ Thực vật (1997).
Điều tra diễn biến một số bệnh hại chính trên cây cói. Chọn khu vực điều tra đại diện.
- Dùng khung có kích thước (0,5m x 0,5m = 0,25m2), mỗi ruộng điều tra 5 điểm chéo góc, mỗi điểm một khung, cách bờ tối thiểu 2 mét. Cố định ruộng điều tra theo các công thức bón phân viên nén chậm tan.
- Đếm số tiêm cói bị bệnh hại, phân cấp bệnh để tính tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh. - Công thức: Tổng số tiêm bị bệnh Tỷ lệ bệnh (%) = --- × 100 Tổng số tiêm điều tra ( a × b) Chỉ số bệnh (%) = --- × 100 NT Trong đó: a: là số tiêm bệnh ở mỗi cấp b: là cấp bệnh tương ứng N: là tổng số tiêm điều tra T: 5 (cấp bệnh cao nhất) - Cấp bệnh được chia như sau:
Cấp 0: tiêm cói không bị bệnh
Cấp 1: Vết bệnh < 10% độ dài tiêm cói
Cấp 2: Vết bệnh từ 10% đến < 25% độ dài tiêm cói Cấp 3: Vết bệnh từ 25% đến < 50% độ dài tiêm cói Cấp 4: Vết bệnh từ 50% đến < 75% độ dài tiêm cói
Cấp 5: Vết bệnh > 75% độ dài tiêm cói hoặc tiêm cói đã bị chết do bệnh.
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
3.4.2.1. Phương pháp phân lập nấm bệnh
Sử dụng phương pháp phân lập nấm theo nguyên tắc Koch Chọn mẫu bệnh có triệu chứng điển hình, mới.
Rửa mẫu bệnh sạch đất cát dưới vòi nước. Thấm khô bằng giấy thấm sạch.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34 Cắt chọn mảnh mô bệnh thích hợp (phần gianh giới giữa mô bệnh và mô khỏe, không lấy phần mô đã bị hoại sinh).
Khử trùng bề mặt các mảnh mô trên trong dung dịch khử trùng bề mặt như Ethanol 70%. Thời gian khử trùng từ 1/2 - 1 phút.
Rửa lại bằng nước cất vô trùng.
Thấm khô mảnh mô bằng giấy thấm vô trùng.
Cắt tiếp bằng dao mổ vô trùng các mảnh mô trên thành các mảnh nhỏ 1 - 3mm (chứa cả phần mô bệnh và mô khoẻ).
Dùng panh vô trùng đặt các mảnh nhỏ trên vào môi trường WA, PSM. Ghi chú cẩn thận bằng bút viết kính: Ngày, cây…
Để mẫu trong điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm.
Theo dõi sự phát triển của sợi nấm mọc ra từ mô bệnh. Khi nấm đã phát triển từ mô bệnh ra môi trường, lấy phần đỉnh sợi nấm chuyển sang môi trường thích hợp.
Cấy truyền nấm liên tiếp khoảng 5 - 6 lần cho đến khi thu được nấm thuần. Toàn bộ việc phân lập được tiến hành trong điều kiện vô trùng và cách ly trong tủ cấy.
3.4.2.2. Nuôi cấy trên môi trường
Mục đích của việc nuôi cấy nấm trên môi trường nhân tạo để nấm hình thành bào tử. Lấy bào tử đi lây bệnh nhân tạo trên cói trồng trong chậu vai tại nhà lưới. Các vết đã lây bệnh nhân tạo có triệu chứng điển hình như vết bệnh trên cói ngoài đồng ruộng. Phân lập lại và thu được nấm.
3.4.3. Phương pháp lây bệnh nhân tạo
Áp dụng phương pháp lây bệnh nhân tạo có vết thương cơ giới và không vết thương cơ giới, theo dõi ngày phát bệnh, tỷ lệ bệnh, đo chiều dài vết bệnh ở 7, 14, 21 ngày sau khi lây để đánh giá tốc độ phát triển của nấm bệnh.
3.4..3.1. Phương pháp lây bệnh nhân tạo bằng dịch bào tử chứa nấm bệnh lên tiêm cói bằng hình thức không có sát thương cơ giới và có sát thương cơ giới
* Đối với nấm Phytophthora sp.
Thu mẫu bệnh đốm vàng do nấm Phytophthora sp. trên tiêm cói, để ẩm ở nhiệt độ 26oC. Nấm phát triển và hình thành rất nhiều bào tử trên bề mặt vết bệnh.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35 Rửa vết bệnh vào nước cất vô trùng để bào tử phân tán trong nước cất. Dùng dung dịch bào tử này để lây bệnh lên một số giống cói trồng trong chậu vại tại nhà lưới.
* Đối với nấm Alternaria sp.
Nuôi cấy nấm trên đĩa môi trường PSA. Dùng nước tween 20 pha 1/10000. Rửa và thu bào tử từđĩa nấm.
Dung dịch bào tử nấm Phytophthora sp. và Alternaria sp. có 2 x 104 bào tử/ ml được dùng để lây bệnh nhân tạo.
Dùng giấy nilon mỏng quấn điểm lây bệnh để giữ giọt dịch bào tử và giữẩm cho điểm lây bệnh.
Hình thức lây có sát thương cơ giới: Dùng kim châm nhẹ vào tiêm cói. Hình thức lây không có sát thương cơ giới
Cách lây: Dùng giấy nilon mỏng buộc ở phía dưới ghim, sau đó nhỏ 1 giọt dung dịch bào tử đã chuẩn bị ở trên xuống đầu ghim để nước chảy vào, lấy phần ghim ra, sau đó quấn kín phần đã lây bệnh lại bằng nilon mỏng.
Chúng tôi lây mỗi giống 30 vết bệnh ở trong nhà lưới và lây ở các giống cói khác nhau.
Sau khi lây 3 ngày thì tháo giấy nilon phía ngoài ra, đánh dấu cụ thể tiêm đã lây bệnh.
Quan sát các tiêm đã lây bệnh. Nếu xuất hiện triệu chứng thì đo chiều dài vết vệnh, đánh dấu những vết đã lây bệnh để tiện lợi cho các lần đo tiếp theo. Chúng tôi tiến hành định kì đo vết bệnh 2 ngày một lần để xác định tốc độ phát triển của vết bệnh, khả năng bị nhiễm bệnh của các giống cói khi lây.
Theo dõi kết quả dựa vào các chỉ tiêu: ngày lây bệnh, ngày phát bệnh, số cây lây bệnh, số cây phát bệnh, tỷ lệ phát bệnh (%).
3.4.3.2. Phương pháp lây bệnh nhân tạo bằng sợi nấm bệnh lên tiêm cói bằng hình thức không có sát thương cơ giới và có sát thương cơ giới
* Đối với nấm Phytophthora sp.
Thu các mẫu bệnh điển hình. Để ấm cho sợi nấm mọc trên bề mặt vết bệnh. Dùng kim mũi mác gạt trên bề mặt vết bệnh để thu sợi nấm. Các sợi nấm này cho vào nước cất vô trùng để mang đi lây bệnh nhân tạo lên tiêm cói tại nhà lưới bằng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36 hình thức có sát thương cơ giới và không có sát thương có giới.
* Đối với nấm Alternaria sp.
Cấy nấm trên đĩa môi trường PSA. Sau 3 ngày nấm mọc thành tản có đường kính 1 - 1,5 cm thì cắt mẩu thạch có sợi nấm áp vào tiêm cói để lây bệnh theo hình thức có sát thương cơ giới và không có sát thương cơ giới.
Dùng giấy nilon mỏng quấn điểm lây bệnh để giữẩm và giữ sợi nấm đã lây ởđây. Chúng tôi lây mỗi giống 30 vết bệnh ở trong nhà lưới và lây ở các giống cói khác nhau.
Sau khi lây 3 - 4 ngày thì tháo giấy nilon phía ngoài ra, đánh dấu cụ thể tiêm đã lây bệnh.
Quan sát các tiêm đã lây bệnh. Nếu xuất hiện triệu chứng thì đo chiều dài vết vệnh, đánh dấu những vết đã lây bệnh để tiện lợi cho các lần đo tiếp theo. Chúng tôi tiến hành định kì đo vết bệnh 2 ngày một lần để xác định tốc độ phát triển của vết bệnh, khả năng bị nhiễm bệnh của các giống cói khi lây.
Theo dõi kết quả dựa vào các chỉ tiêu: ngày lây bệnh, ngày phát bệnh, số cây lây bệnh, số cây phát bệnh, tỷ lệ phát bệnh (%).
Tất cả các thí nghiệm dùng nilon tự hủy đều phải được tháo ra sau lây nhiễm 3 ngày.
3.4.4. Phương pháp nghiên cứu khả năng ức chế sự phát triển của nấm
Alternaria sp. trên môi trường nhân tạo của một số thuốc trừ nấm
Thí nghiệm sẽ được tiến hành với 3 loại thuốc ở 2 nồng độ khác nhau và được tiến hành như sau:
Công thức 1: Aliette 800WG nồng độ 0,01% Công thức 2: Aliette 800WG nồng độ 0,05% Công thức 3: Ridomil Gold 68WG nồng độ 0,01% Công thức 4: Ridomil Gold 68WG nồng độ 0,05% Công thức 5: Vicarben 50SC nồng độ 0,01% Công thức 6: Vicarben 50SC nồng độ 0,05% Công thức 7: Không có thuốc
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37 - Đối với thuốc dạng rắn:
Cách tiến hành: Cân thuốc theo các lượng cần thí nghiệm, cho thuốc đã cân vào 3ml nước cất vô trùng, lắc cho thuốc tan, rồi đổ vào môi trường PSA đã hấp khử trùng, để nguội 50-600C, lắc đều, đổ môi trường có thuốc vào 3 đĩa petri đường kính 9cm. Để nguội, cấy nấm vào giữa đĩa.
-Đối với thuốc dạng lỏng:
Cách tiến hành: Dùng micropipet lấy lượng thuốc theo từng công thức thí nghiệm. Cho thuốc vào cốc, cho thêm 3ml nước cất vô trùng, lắc cho tan đều rồi đổ vào môi trường PSA để nguội 50-600C, lắc đều, đổ môi trường có thuốc vào 3 đĩa petri có đường kính 9cm. Để nguội, cấy nấm vào giữa đĩa.
* Chuẩn bị nấm
Dùng đĩa môi trường PSA cấy nấm Alternaria sp.. Khi nấm phát triển kín đĩa, dùng đột đột các khoanh nấm có đường kính 5mm. Cấy khoanh nấm này vào giữa đĩa môi trường có nồng độ thuốc khác nhau đã được chuẩn bị sẵn ở trên. Mỗi công thức làm 3 đĩa (3 lần nhắc lại).
Đo đường kính tản nấm sau cấy 2, 4, 6, 8, 10 ngày. Đếm bào tử trên buồng đếm hồng cầu.
- Ngày xử lý thuốc: ngày 21/05/2014
- Hiệu lực thuốc được tính theo công thức Abbott: C – T H (%) = x 100 C H (%): Hiệu lực của thuốc C: Đường kính tản nấm ởđĩa có thuốc T: Đường kính tản nấm ởđĩa đối chứng * Công thức tính số bào tử: - Số bào tử của 3,2mm3 thể tích ô kính: A = n x 256 Trong đó: A: số bào tử của 3,2 mm3 thể tích ô kính
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 38 n: số bào tử trung bình của 1 ô con
- Số bào tử/1ml: A x 1000 B = --- 3,2 Trong đó: B: số bào tử/1ml A: số bào tử của 3,2 mm3 thể tích ô kính - Số bào tử trên 1cm2đĩa cấy: B x L C = --- S Trong đó: C: số bào tử trên 1cm2đĩa cấy S: diện tích tản nấm B: số bào tử/1ml L: số ml nước dùng để rửa nấm (L = 2ml) 3.4.5. Phương pháp xác định hiệu lực của thuốc đối với bệnh đốm vàng do nấm
Phytophthora sp. và bệnh vàng ngọn do nấm Alternaria sp. hại cói trên đồng
ruộng
• Thí nghiệm 1: Xác định hiệu lực của thuốc Aliette 800WG ở nồng độ khác nhau đối với bệnh đốm vàng và bệnh vàng ngọn hại cói trên đồng ruộng
Công thức 1: Aliette 800WG nồng độ 0.15% Công thức 2: Aliette 800WG nồng độ 0.2% Công thức 3: Aliette 800WG nồng độ 0.25% Công thức 4: Aliette 800WG nồng độ 0.30% Công thức 5: Không phun thuốc
• Thí nghiệm 2: Xác định hiệu lực của thuốc Ridomil Gold 68WG ở nồng độ khác nhau đối với bệnh đốm vàng và bệnh vàng ngọn hại cói trên đồng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39 Công thức 2: Ridomil Gold 68WG nồng độ 0.3%
Công thức 3: Ridomil Gold 68WG nồng độ 0.4% Công thức 3: Ridomil Gold 68WG nồng độ 0.5% Công thức 5: Không phun thuốc
• Thí nghiệm 3: Xác định hiệu lực của thuốc Vicarben 50SC ở nồng độ khác nhau đối với bệnh đốm vàng và bệnh vàng ngọn hại cói trên đồng
Công thức 1: Vicarben 50SC nồng độ 0.15% Công thức 2: Vicarben 50SC nồng độ 0.2% Công thức 3: Vicarben 50SC nồng độ 0.25% Công thức 3: Vicarben 50SC nồng độ 0.3% Công thức 5: Không phun thuốc
Ngày xử lý thuốc: ngày 28/04/2014
Diện tích mỗi công thức 50m2, nhắc lại 3 lần, bố trí thí nghiệm theo kiểu khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh RCBD.
Điều tra: tiến hành điều tra tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh trước phun 1 ngày. Điều tra