3. Ý nghĩa lí luận và ý nghĩa thực tiễn
1.6. Nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng trong công tác nhân giống
1.6.1. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy từ nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trƣờng nhân tạo trong điều kiện vô trùng. Cho đến nay, nuôi cấy mô tế bào thực vật đƣợc xem giải pháp công nghệ quan trọng trong công nghệ sinh học nói chung. Trên môi trƣờng nhân tạo, từ các hormon và các cơ quan thực vật ban đầu có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh và chỉ trong một thời gian ngắn
Nguyễn Thị Hồng Hạnh 25 K37A - Sinh
có thể tạo ra một lƣợng lớn cây trồng có cấu trúc di truyền và các đặc điểm sinh học giống hệt nhau.
1.6.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào thực vật 1.6.2.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật
Năm 1902, Haberlandt (Đức) là ngƣời đầu tiên đề xƣớng học thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy mô tế bào tách rời”. Theo ông: “Mỗi tế bào của một cơ thể đa bào đều mang trong mình đầy đủ các thông tin di truyền để kiến tạo nên một cơ thể hoàn chỉnh. Vì vậy, khi đặt tế bào vào trong điều kiện thuận lợi, nó có thể phát triển thành một cơ thể”. Tính toàn năng của một tế bào cho phép từ những cơ quan, bộ phận của cơ thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh đồng nhất về mặt di truyền với cây mẹ [31].
1.6.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào
Sự phân hoá là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sinh sang tế bào chuyên hoá để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hoá khác nhau.
Sự phản phân hóa là sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi sinh để thực hiện chức năng phân chia.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào dựa trên tính toàn năng của tế bào thực vật.
1.7. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.7.1. Vật liệu nuôi cấy
Cơ thể thực vật đa bào đều có tính toàn năng nghĩa là đều có khả năng phân hóa tái sinh thành một cây hoàn chỉnh từ một tế bào, mô, cơ quan trong môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo và môi trƣờng có điều kiện thích hợp. Do
Nguyễn Thị Hồng Hạnh 26 K37A - Sinh
vậy về nguyên tắc bất kỳ một bộ phận nào của cây cũng có thể sử dụng làm vật liệu nuôi cấy, có thể là cơ thể thực vật nguyên vẹn nhƣ cây con, mầm non, các mô sẹo, các tế bào đơn, tế bào trần,...
Tuy nhiên, khả năng này phụ thuộc vào từng loài, có loài dễ tái sinh từ mô nuôi cấy nhƣ Khoai tây, Cà chua, Thuốc lá,... có loài rất khó nhƣ hoa Đồng tiền, Trầm hƣơng,... Thông thƣờng các giai đoạn sinh trƣởng khác nhau của mô cũng nhƣ các bộ phận khác nhau của cây, khi nuôi cấy sẽ cho những kết quả khác nhau 7, 8. Điều đáng chú ý là những mô nuôi cấy có nguồn gốc từ cây in vitro có khả năng phát sinh, phát triển tốt hơn so với những mô nuôi cấy có nguồn gốc là những cây ngoài tự nhiên hay trong nhà kính. Nhìn chung, tất cả các bộ phận nhƣ thân, lá, rễ, cuống lá,... đều có thể sử dụng để nuôi cấy, nhƣng các cơ quan này do có sự chuyển hoá khác nhau nên quá trình giải mã các thông tin di truyền trong đó để tạo mô, tạo chồi, tạo rễ, tái sinh cây,... là cũng rất khác nhau.
Kích thƣớc mô nuôi cấy khác nhau sẽ cho các phản ứng không giống nhau và có liên quan mật thiết với tỷ lệ sống, cũng nhƣ mức độ ổn định về mặt di truyền của mô cấy. Do đó, tuỳ từng đối tƣợng, từng loại mô và mục đích sử dụng mà ngƣời ta nuôi cấy mô có kích thƣớc khác nhau cho phù hợp.
1.7.2. Môi trường nuôi cấy
Mô nuôi cấy bị tách rời ra khỏi cơ thể mẹ nên mất khả năng tự dƣỡng. Vì vậy, để cho mô tồn tại và phân hóa thì trong các giai đoạn nuôi cấy phải tạo ra đƣợc môi trƣờng có đủ các chất dinh dƣỡng mà cây cần thiết. Thành phần hoá học của môi trƣờng dinh dƣỡng gồm chủ yếu là muối khoáng, nguồn cacbon, chất điều hoà sinh trƣởng,... Cho đến nay, đã có nhiều loại môi trƣờng dinh dƣỡng đƣợc tìm ra: môi trƣờng Murashige và Skoog (l962)
Nguyễn Thị Hồng Hạnh 27 K37A - Sinh
Gamborg (1968) [30]… Đây là những môi trƣờng cơ bản và sẽ đƣợc cải biến ra nhiều loại môi trƣờng khác nhau cho phù hợp với mỗi đối tƣợng nghiên cứu và mục đích thí nghiệm. Trong số đó, môi trƣờng MS đƣợc đánh giá là phù hợp nhất cho đa số loài thực vật 8.
Thành phần của môi trƣờng nuôi cấy tế bào thay đổi tùy theo từng loại thực vật, loại tế bào, mô, cơ quan đƣợc nuôi cấy, các giai đoạn sinh trƣởng, phát triển của mẫu cấy cũng nhƣ mục đích nuôi cấy. Tuy nhiên môi trƣờng nuôi cấy mô tế bào thực vật đặc trƣng đều chứa các thành phần sau:
- Các nguyên tố đa lƣợng (muối nitơ, phốt pho, magie, canxi, kali, lƣu huỳnh): là thành phần không thể thiếu đƣợc vì chúng tham gia cấu thành các cơ quan tử trong cơ thể thực vật.
- Các nguyên tố vi lƣợng (muối sắt, kẽm, đồng, mangan, coban, molipden, bo, iot). Các nguyên tố này tuy có hàm lƣợng thấp nhƣng có vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự phát triển của thực vật ở giai đoạn xuân hóa, ngoài ra chúng còn là thành phần của enzym, xúc tác cho các phản ứng sinh hóa trong cơ thể. Ví dụ thiếu sắt tế bào mất khả năng phân chia, thiếu bo gây thừa auxin làm mô nuôi cấy có biểu hiện mô sẹo hóa mạnh nhƣng lại xốp, mọng nƣớc và tái sinh kém, molipđen tác động trực tiếp lên quá trình trao đổi đạm trong tế bào thực vật 3.
- Nguồn cabon: khi nuôi cấy in vitro thì các tế bào thực vật không có khả năng quang hợp nên đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon để tạo năng lƣợng cho các quá trình sinh lí, sinh hóa diễn ra bình thƣờng trong tế bào. Đƣờng saccarozơ là nguồn cacbon tốt nhất thƣờng đƣợc sử dụng với nồng độ 2- 3%. Đƣờng có thể bị caramen hóa nếu bị hấp khử trùng quá lâu và sẽ ức chế phản ứng với các hợp chất melanoidin, một chất sẫm màu có phân tử lƣợng cao, ức chế sự phát triển của tế bào 8.
Nguyễn Thị Hồng Hạnh 28 K37A - Sinh
- Các vitamin: mô và các tế bào nuôi cấy tuy có tổng hợp đƣợc vitamin nhƣng không đủ nên thƣờng phải bổ sung vitamin vào môi trƣờng nuôi cấy chủ yếu là: thiamin (B1) đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi cacbon và tham gia vào thành phần tổ hợp enzim xúc tác quá trình oxi hóa khử dehydrogenase xúc tác việc tách hydro ra khỏi các axit hữu cơ; pyridoxin (B6) tham gia vào thành phần các enzym khử cacbon và thay đổi vị trí nhóm amin trong các axit amin; myo - insitol giúp cải thiện sự tăng trƣởng của mô, có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào. Vitamin rất nhạy cảm với sự tăng trƣởng của mô nuôi cấy, vitamin đƣợc sử dụng ở nồng độ thấp, nó có vai trò quan trọng trong sự tổng hợp tế bào 3.
- Các chất có nguồn gốc tự nhiên phức tạp: nƣớc Dừa, dịch chiết muối, dịch chiết Cà chua, dịch chiết Nấm men, dịch thủy phân Cazein,… cũng đƣợc sử dụng trong nuôi cấy in vitro vì thành phần của chúng có nhiều chất thúc đẩy tăng trƣởng tế bào và mô nuôi cấy. Nƣớc Dừa bổ sung vào môi trƣờng các loại đƣờng, protein, các axit hữu cơ, các axit amin, các chất kích thích sinh trƣởng, các vitamin và các chất quan trọng khác có tác dụng tốt trong tăng trƣởng của mô 27.
- Các chất làm rắn môi trƣờng: agar là một polysaccaride thu đƣợc từ một số tảo thuộc ngành Tảo đỏ. Agar đƣợc sử dụng để làm rắn môi trƣờng, tạo giá thể nâng đỡ cây. Tùy đặc điểm nuôi cấy và chất lƣợng agar mà nồng độ sử dụng thay đổi từ 0,8- 1,0%. Nếu sử dụng với nồng độ quá cao sẽ làm môi trƣờng quá cứng và ảnh hƣởng tới sự khuếch tán cũng nhƣ hấp thụ dinh dƣỡng của mô, tế bào. Nếu nhƣ agar không tinh sạch thì nó có thể làm đục màu môi trƣờng do các chất cặn trong agar gây nên. Agar có thể ảnh hƣởng đến kết quả thí nghiệm bởi vì agar là một sản phẩm lấy từ tảo biển, nó có thể có những tác động sinh lí trên mô thực vật. Ngoài agar, một số hợp chất khác cũng đã đƣợc thử nghiệm thành công để làm rắn môi trƣờng nhƣ Gerlit
Nguyễn Thị Hồng Hạnh 29 K37A - Sinh
(là một polysaccarit tinh và trong suốt đƣợc hình thành trong quá trình lên men của Pseudomonas 27.
- Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật: phytohoocmon là thành phần quan trọng bậc nhất của môi trƣờng nuôi cấy. Nhờ những chất này mà các nhà nghiên cứu có thể điều chỉnh quá trình phát sinh hình thái thực vật in vitro. Trong nuôi cấy mô tế bào hai nhóm chất điều hòa sinh trƣởng đƣợc sử dụng rộng rãi là auxin và xytokynin:
Auxin là chất điều khiển sinh trƣởng chủ yếu kích thích sinh trƣởng tế bào làm tăng phân bào, gây hiện tƣợng ƣu thế ngọn, kích thích sự hình thành rễ 3. Nhóm auxin bao gồm IAA, IBA, - NAA, 2,4 - D có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp kích thích ra rễ, ở liều lƣợng cao auxin sẽ phát động sự tạo mô sẹo và thƣờng gây nên các đột biến 27. 2,4 - D thƣờng đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc phát sinh mô sẹo; IAA, IBA, - NAA thƣờng đƣợc sử dụng trong việc phát sinh rễ 8.
Xytokynin là nhóm các phytohoocmon dẫn xuất của ađênin nó liên quan chặt chẽ đến quá trình phân bào, kích thích phân hóa chồi từ mô cấy. Các xytokynin thƣờng dùng trong nuôi cấy là kinetin, BA, zeatin giúp tạo số lƣợng chồi nhiều nhƣng có kích thƣớc nhỏ 8, có thể gây ra hiện tƣợng mọng nƣớc (thủy tinh thể và kìm hãm sự tạo rễ). Theo Skoog và Miller, tỷ lệ auxin/xytokynin cao thƣờng có xu thế kích thích quá trình tạo rễ bất định, kéo dài chồi, ngƣợc lại tỷ lệ trên thấp thì sẽ đẩy mạnh biệt hóa chồi và ức chế sự phát triển chồi, nếu tỷ lệ trung bình thì mô sẹo sẽ đƣợc hình thành
27.
Ngoài ra trong nuôi cấy mô tế bào ngƣời ta còn sử dụng nhóm phytohoocmon khác là GA (Gibberellic axit). Gibberelin điển hình là GA3 có tác dụng kích thích kéo dài lóng đốt và sự sinh trƣởng của cây, phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của cây,… Nhƣng so với auxin và xytokynin thì nhóm
Nguyễn Thị Hồng Hạnh 30 K37A - Sinh
GA rất ít đƣợc sử dụng vì có biểu hiện ức chế sinh trƣởng và phát sinh hình thái thực vật in vitro, đặc biệt là với mô thực vật một lá mầm, GA3 đƣợc đƣa vào môi trƣờng trong những trƣờng hợp cần thiết để kéo dài những chồi bất định hoặc kích thích tái sinh chồi ở một số loài thực vật 27.
- pH của môi trƣờng là một yếu tố quan trọng. Sự ổn định pH của môi trƣờng là yếu tố duy trì trao đổi các chất trong tế bào. Ngoài ra sự bền vững và hấp thụ các chất phụ thuộc vào pH môi trƣờng, đặc biệt mẫn cảm với pH môi trƣờng là NAA, gibberellin và các vitamin. Sự hấp thụ các hợp chất sắt cũng phụ thuộc vào pH. pH môi trƣờng thƣờng ở 5,5 - 5,8 trƣớc khi khử trùng 21. Giá trị pH đầu tiên của môi trƣờng ảnh hƣởng không nhỏ tới sự sinh trƣởng và tổng hợp của tế bào. Khi pH môi trƣờng thấp sẽ hoạt hóa các enzym hydrolase, dẫn tới kìm hãm sinh trƣởng đồng thời kích thích sự già hóa của tế bào trong mô nuôi cấy 14. Giá trị pH đầu tiên của môi trƣờng nuôi cấy luôn luôn ở trong khoảng 5,5 - 5,9. Vì hầu hết trong môi trƣờng nuôi cấy đều không có chất đệm nên giá trị pH sẽ thay đổi trong quá trình khử trùng môi trƣờng và trong quá trình nuôi cấy. Giá trị pH giảm nhanh chóng xuống 4,0 - 4,5 trong vòng 24 - 28 giờ sau khi cấy tế bào vào môi trƣờng nuôi. Những thay đổi này liên quan đến sự hấp thụ amonium của tế bào.Tuy nhiên, giá trị pH sẽ tăng lên sau vài ngày và giữ ở mức độ ổn định 5,0 - 5,5 do có liên quan đến sự hấp thụ nitrate.
1.7.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
- Nhiệt độ: nhiệt độ ảnh hƣởng đến sự phân chia tế bào và quá trình trao đổi chất trong mô nuôi cấy, ảnh hƣởng đến sự phát triển của từng tế bào riêng lẻ và khả năng tạo các cơ quan của mô nuôi cấy. Nhiệt độ thích hợp sẽ ảnh hƣởng tích cực đến quá trình sinh trƣởng của đa số các loại thực vật nuôi cấy. Nhiệt độ rất thấp còn đƣợc sử dụng làm chậm hay ngừng sinh
Nguyễn Thị Hồng Hạnh 31 K37A - Sinh
trƣởng hẳn của mầm nuôi cấy nhằm mục đích bảo quản giống ở điều kiện in vitro. Trong thực tế, nhiệt độ của phòng nuôi cấy thƣờng đƣợc điều chỉnh ổn định 250
C 10C, điều này là do nhiệt độ thật của các mô nuôi cấy trong bình nuôi cấy có thể cao hơn 2 - 40C so với nhiệt độ của phòng. Thông thƣờng, ngƣời ta điều chỉnh nhiệt độ phòng nuôi cấy trung bình. Các loại cây sống ở vùng ôn đới thƣờng quen với nhiệt độ thấp hơn là cây nhiệt đới, chính vì vậy mà ngƣời ta sẽ có lợi hơn khi có những phòng nuôi cấy có nhiệt độ 200C
10C dành cho cây nhiệt đới 8.
- Ánh sáng: bao gồm cƣờng độ, thời gian và chất lƣợng ánh sáng. Khi chuẩn bị cho cây con ra ngoài vƣờn ƣơm nếu gia tăng cƣờng độ ánh sáng thì sẽ “tăng sức” cho cây con 8. Trong thực tế ở phần lớn các phòng thí nghiệm thời gian chiếu sáng 16 - 18 giờ/ngày đƣợc coi là tốt nhất cho nuôi cấy mô 6. Chất lƣợng ánh sáng cũng ảnh hƣởng không nhỏ đến quá trình sinh trƣởng của mô nuôi cấy và có liên quan đến sự thay đổi nồng độ hoocmon nội sinh. Các kết quả này cùng với các kết quả nghiên cứu khác cho thấy quá trình phát sinh hình thái của thực vật đƣợc điều chỉnh bởi các sắc tố nhận ánh sáng: chất phytochrom và các chất khác 8.
1.8. Các nguyên tắc kỹ thuật về nhân giống in vitro
Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy
Đây là giai đoạn tối quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này là tạo ra đƣợc nguyên liệu thực vật vô trùng để đƣa vào nuôi cấy in vitro. Khử trùng mô thực vật, ngƣời ta thƣờng dùng một số chất hoá học nhƣ HgCl2, Ca(OCl)2, NaOCl, H2O2. Tùy thuộc vào từng loại mô thực vật mà lựa chọn nồng độ và thời gian xử lý hoá chất thích hợp.
Nguyễn Thị Hồng Hạnh 32 K37A - Sinh
Toàn bộ quá trình nhân giống in vitro xét cho cùng là nhằm mục đích tạo ra hệ số nhân cao nhất. Chính vì vậy giai đoạn này đƣợc xem là giai đoạn then chốt của quá trình.
Để tăng hệ số nhân ngƣời ta thƣờng phải đƣa thêm vào môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trƣởng (auxin, xytokynin, gibberellin,...). Các chất bổ sung khác nhƣ nƣớc Dừa, nƣớc chiết nấm men, dịch thủy phân Casein,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Tùy thuộc vào từng đối tƣợng nuôi cấy ngƣời ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển của chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính.
Giai đoạn 3: Tạo cây hoàn chỉnh