b. Hoạt chất Iprobenfos
3.4.3. Xác định ảnh hưởng của Iprobenfos lên hoạt tính enzyme cholinesterase
a. Thu mẫu và bảo quản
Mẫu cá được thu tại các thời điểm: 1 ngày trước khi phun thuốc, và 1, 3, 5, 7, 14 ngày sau khi phun để phân tích ChE trong não cá.
Mỗi lần thu 18 cá (2 cá/lồng cho 9 lồng, kể cả đối chứng). Sau khi bắt, cá được giết bằng cách đưa vào nước đá và được chuyển về phịng thí nghiệm, sau đĩ mổ lấy não cho vào từng enpendoft đã đánh dấu riêng biệt, nghiền, trữ lạnh và phân tích ngay bằng máy so màu quang phổ.
Các yếu tố như: mực nước, nhiệt độ, oxy, pH được đo 2 ngày/lần vào lúc 7:00 - 7:30 và 14:00 - 14:30 tại các địa điểm đặt lồng cá.
28
Cá được giết bằng nước đá sau đĩ dùng kéo cắt dọc hai bên mang cá để lộ hộp sọ; tiếp tục dùng kéo cắt dọc hai bên hộp sọ, bắt đầu từ mắt đến giáp giữa xương sống và hộp sọ, cắt ngang hộp sọ giữa hai mắt cá và cắt ngang hộp sọ với xương sống dùng kẹp lấy lớp xương vừa cắt ra, não cá sẽ lộ ra và khi đĩ dùng kẹp gắp não ra cho vào enpendoft được giữ lạnh. Sau đĩ cân trọng lượng não cá.
Hình 3.8: Mổ lấy não và nghiền não cá
c. Phân tích ChE
Mẫu não được nghiền riêng biệt trong dung dịch đệm 0,1 M phosphate buffer pH 7,4 bằng cối nghiền. Thể tích dung dịch đệm cho vào đảm bảo tất cả các não đều cĩ nồng độ 20 mg não/mL dung dịch đệm pH 7,4. Sau mỗi lần nghiền, rửa dụng cụ nghiền bằng nước cất – acetone – nước cất. Mẫu được trộn đều, lấy 1ml dung dịch này cho vào enpendoft rồi đem ly tâm ở tốc độ 2000 vịng/phút trong 20 phút. Phần trong phía trên mẫu ly tâm được lấy ra đo ChE.
ChE được đo bằng máy so màu quang phổ ở bước sĩng 412 nm trong 200 giây dựa theo phương pháp Ellman et al., (1961). Mỗi mẫu đo được chuẩn bị bằng cách cho 2,65 mL 0,1 M Phosphate bufer pH 7,4 vào cuvest nhựa (cĩ thể làm cho nhiều cuvest), tiếp tục cho 0,1 mL dung dịch 3mM DTNB và 0,05 mL dung dịch 10 mM Acetylthiocholine iodide. Sau đĩ, cho 0,2 mL dung dịch mẫu não đã ly tâm vào và bắt đầu đo. Mẫu trắng cũng cĩ hĩa chất tương tự như mẫu đo ChE nhưng lấy 0,2 mL dung dịch đệm 0,1 M phosphate pH 7,4 thay cho dung dịch mẫu não. Kết quả được ghi nhận khi hệ số tương quan (r2) đạt từ 0,9 trở lên.