b. Hoạt chất Iprobenfos
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí ở 2 ruộng lúa ở Quận Bình Thủy, thành phố Cần Thơ. Ruộng thí nghiệm cĩ diện tích là 900 m2, vị trí tiếp giáp với kênh, lộ, vườn trái cây, mặt cịn lại tiếp giáp với ruộng khác; cĩ mương bao 2 mặt của ruộng. Ruộng đối chứng cĩ diện tích là 1.350 m2 các mặt tiếp giáp với lộ, vườn trái cây và 2 mặt cịn lại tiếp giáp với ruộng khác.
Đặt 3 lồng bằng lưới cĩ kích thước (0,5x0,4x0,5 m) trên ruộng lúa và 3 lồng lưới (0,5x0,4x0,5 m) trên mương (Hình 3.3). Thả 30 cá vào mỗi lồng 1 tuần rồi cung cấp thuốc KiSaiGon 50ND (chứa 50% hoạt chất Iprobenfos) cho nơng dân phu theo liều lượng chỉ dẫn ghi trên nhãn chai, khi lúa được 45 ngày tuổi. Ruộng chỉ được phun 1 lần trong thời gian thí nghiệm.
Hình 3.3: Sơ đồ vị trí đặt các lồng cá
Nghiệm thức đối chứng được bố trí ngồi ruộng lúa bằng lồng lưới, 3 lồng lưới được đặt theo đường chéo của ruộng, kích thước tương tự như các lồng khác, nơi khơng cĩ phun hố chất Iprobenfos.
L3
L2
L1 L4
L5 L6
25
Hình 3.4: Vị trí đặt các lồng cá trên ruộng và mương
3.4.2 Xác định dư lượng hĩa chất Iprobenfos trong nước a. Thu và bảo quản mẫu a. Thu và bảo quản mẫu
Mẫu nước được thu ở các thời điểm: trước khi phun thuốc, sau khi phun 1 giờ và 1, 3, 7, 14 ngày sau khi phun để phân tích nồng độ hoạt chất Iprobenfos. Mẫu nước được thu trong chai nhựa, thể tích thu là 500 mL, thu mẫu nước ở từng vị trí đặt lồng cá, mỗi vị trí thu 2 chai cho 1 lần thu.Mẫu nước được trữ lạnh ngay sau khi thu và trữ đơng ở phịng thí nghiệm cho đến khi phân tích. Hàm lượng Iprobenfos trong mẫu nước được phân tích tại phịng thí nghiệm Khoa Mơi Trường và Tài Nguyên Thiên Nhiên, Đại học Cần Thơ.
b. Phương pháp ly trích thuốc BVTV từ nước
Mẫu nước sau khi được thu trực tiếp từ ruộng sẽ được lọc qua giấy lọc cĩ kích thước lỗ là 0,45 µm để loại bỏ chất rắn lơ lửng, mẫu nước sau khi lọc xong sẽ cho vào 15 % NaCl vào.
Tiếp theo là hoạt hĩa cột lọc Superclean LC-18 SPE bằng 2 mL methanol và 2 ml nước cất. Sau khi hoạt hĩa cột lọc, cho mẫu qua cột lọc để hấp phụ Iprobenfos. Bước tiếp theo là rửa giải cột lọc bằng acetone.
Dung dịch sau khi rữa giải được cơ đặc bằng cách thổi khí nitơ đến khi gần cạn và ngừng thổi khí, sau đĩ cho dung dịch vừa cơ cạn vào vial khoảng 1ml để phân tích bằng máy GCMS – QP 2010. NT2 NT3 NT5 NT6 NT1 NT4
26
Hình 3.5: Sơ đồ ly trích Iprobenfos trong nước
c. Phương pháp phân tích Iprobenfos bằng máy GCMS – QP2010
Phân tích được thực hiện bằng cách sử dụng hệ thống GC - MS QP 2010 trang bị 1 mẫu tự động AOC - 20i Shimadzu và cột mao quản Silica DB - 5ms (30 m x 0,25 mm id., độ dày 0,25 µm, from J&W scientific, Folsom, CA, USA). Chương trình nhiệt trong quá trình phân tích được thiết lập như sau: 2 phút đầu ổn nhiệt ở 700C và sau đĩ nhiệt độ tăng lên 1500C với tốc độ 180C/phút và giữ trong 1 phút, sau đĩ tăng đến 2000C với tốc độ 30C/phút và cuối cùng tăng đến 2800C với tốc độ 80C/phút và được giữ trong 15 phút. Khí mang sử dụng là Helium với tốc độ dịng 1 ml/phút. Thể tích tiêm mẫu là 1 µL. Ba mảnh ion được cài đặt để theo dõi cho hợp chất là 204, 123 và 288. Thời gian lưu cho hoạt chất Iprobenfos trong thí nghiệm này được xác định là ở phút thứ 20,15 sau khi tiêm mẫu.
Lọc mẫu nước qua giấy lọc 0,5 µm
Hoạt hĩa cột Superclean LC – 18 SPE Cho mẫu nước qua cột
C18
Làm khơ cột C18 Rửa cột C18 Bay hơi mẫu
GCMS Cho vào Vial
27
Hình 3.6: Máy sắc ký phối phổ GCMS và hoạt hĩa cột lọc
Hình 3.7: Sắc ký đồ chạy chuẩn Iprobenfos (5 mg/L) bằng GCMS
3.4.3 Xác định ảnh hưởng của Iprobenfos lên hoạt tính enzyme Cholinesterase a. Thu mẫu và bảo quản a. Thu mẫu và bảo quản
Mẫu cá được thu tại các thời điểm: 1 ngày trước khi phun thuốc, và 1, 3, 5, 7, 14 ngày sau khi phun để phân tích ChE trong não cá.
Mỗi lần thu 18 cá (2 cá/lồng cho 9 lồng, kể cả đối chứng). Sau khi bắt, cá được giết bằng cách đưa vào nước đá và được chuyển về phịng thí nghiệm, sau đĩ mổ lấy não cho vào từng enpendoft đã đánh dấu riêng biệt, nghiền, trữ lạnh và phân tích ngay bằng máy so màu quang phổ.
Các yếu tố như: mực nước, nhiệt độ, oxy, pH được đo 2 ngày/lần vào lúc 7:00 - 7:30 và 14:00 - 14:30 tại các địa điểm đặt lồng cá.
28
Cá được giết bằng nước đá sau đĩ dùng kéo cắt dọc hai bên mang cá để lộ hộp sọ; tiếp tục dùng kéo cắt dọc hai bên hộp sọ, bắt đầu từ mắt đến giáp giữa xương sống và hộp sọ, cắt ngang hộp sọ giữa hai mắt cá và cắt ngang hộp sọ với xương sống dùng kẹp lấy lớp xương vừa cắt ra, não cá sẽ lộ ra và khi đĩ dùng kẹp gắp não ra cho vào enpendoft được giữ lạnh. Sau đĩ cân trọng lượng não cá.
Hình 3.8: Mổ lấy não và nghiền não cá
c. Phân tích ChE
Mẫu não được nghiền riêng biệt trong dung dịch đệm 0,1 M phosphate buffer pH 7,4 bằng cối nghiền. Thể tích dung dịch đệm cho vào đảm bảo tất cả các não đều cĩ nồng độ 20 mg não/mL dung dịch đệm pH 7,4. Sau mỗi lần nghiền, rửa dụng cụ nghiền bằng nước cất – acetone – nước cất. Mẫu được trộn đều, lấy 1ml dung dịch này cho vào enpendoft rồi đem ly tâm ở tốc độ 2000 vịng/phút trong 20 phút. Phần trong phía trên mẫu ly tâm được lấy ra đo ChE.
ChE được đo bằng máy so màu quang phổ ở bước sĩng 412 nm trong 200 giây dựa theo phương pháp Ellman et al., (1961). Mỗi mẫu đo được chuẩn bị bằng cách cho 2,65 mL 0,1 M Phosphate bufer pH 7,4 vào cuvest nhựa (cĩ thể làm cho nhiều cuvest), tiếp tục cho 0,1 mL dung dịch 3mM DTNB và 0,05 mL dung dịch 10 mM Acetylthiocholine iodide. Sau đĩ, cho 0,2 mL dung dịch mẫu não đã ly tâm vào và bắt đầu đo. Mẫu trắng cũng cĩ hĩa chất tương tự như mẫu đo ChE nhưng lấy 0,2 mL dung dịch đệm 0,1 M phosphate pH 7,4 thay cho dung dịch mẫu não. Kết quả được ghi nhận khi hệ số tương quan (r2) đạt từ 0,9 trở lên.
3.4.4 Phương pháp tính tốn a. Xử lý kết quả a. Xử lý kết quả
Hoạt tính enzyme ChE:
HT= s v v v xP ExLxS xH AxC
29 Trong đĩ:
+ HT (hoạt tính): µmol/g/phút
+ A: Abs mẫu - Abs blank (Abs/phút)
+ Cv: thể tích cuvest hay tổng thể tích dung dịch đo (mL) = 3 mL + Hv: thể tích buffer sử dụng để nghiền mẫu
+ E: hệ số =13,6
+ L: chiều dài cuvet (cm) =1 cm
+ Sv: thể tích mẫu sau ly tâm lấy đo (mL) = 0,2 mL + Ps: trọng lượng mẫu lấy nghiền (g)
Tỷ lệ ức chế TLUC =100 – 100 ChEtbdc ChEs Trong đĩ: + TLUC: tỉ lệ ức ChE bị ức chế (%)
+ ChEs: là hoạt tính ChE đo được từng mẫu (µmol/g/phút)
+ ChEtbdc: là hoạt tính ChE trung bình của nghiệm thức đối chứng ở từng thời điểm (µmol/g/phút)
b. Xử lý số liệu
Các số liệu thơ về hoạt tính ChE và nồng độ Iprobenfos được kiểm tra tính đồng nhất của phương sai và phân phối chuẩn trước khi thực hiện các phép thống kê. Số liệu phân phối chuẩn sẽ được phân tích phương sai (ANOVA) và so sánh trung bình ChE các nghiệm thức với đối chứng bằng kiểm định Dunnett. So sánh khác biệt các chỉ tiêu ở các thời điểm trong cùng 1 nghiệm thức bằng kiểm định Duncan. Kiểm tra sự khác biệt nồng độ Iprobenfos giữa 2 nghiệm thức ruộng, mương ở từng thời điểm bằng kiểm định T Test thơng qua sử dụng IBM SPSS Statistics 20. Sai khác cĩ ý nghĩa thống kê ở mức 95% (p<0,05).
30
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nhiệt độ, pH, DO và mực nước trong thời gian thí nghiệm a. Biến động nhiệt độ ở ruộng thí nghiệm
Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến đến sinh trưởng và phát triển của sinh vật. Trong thí nghiệm này, nhiệt độ biến động cao nhất và thấp nhất ở 3 nghiệm thức đối chứng, ruộng, mương nằm trong khoảng từ 28±0,090C đến 32±0,060C. Ở từng nghiệm thức cĩ sự chênh lệch nhiệt độ giữa hai buổi sáng và chiều ở tất cả các ngày đo, nhiệt độ buổi chiều luơn luơn cao hơn buổi sáng. Trung bình nhiệt độ ở ruộng đối chứng dao động thấp nhất và cao nhất trong khoảng từ 28,5±0,06 (buổi sáng 7 - 8 giờ) đến 32±0,060C (buổi chiều 14 - 15 giờ), chênh lệch 3,50C. Nhiệt độ ở ruộng giữa 2 buổi sáng, chiều dao động trong khoảng 28±0,090C đến 31,5±0,090C, chênh lệch 3,50C; trong khi đĩ ở mương bao dao động từ 27,8±0,17 đến 31,8±0,170C, chênh lệch 40C (Bảng 4.1).
Bảng 4.1: Nhiệt độ (0C) trong thời gian thí nghiệm
Thời gian
Đối chứng Ruộng Mương bao
Sáng Chiều Sáng Chiều Sáng Chiều
Trước phun 29,2±0,09 31,1±0,06 29,2±0,17 31,5±0,29 29±0,06 31±0,09 Ngày 1 29,5±0,06 31,1±0,13 29,1±0,07 30,9±0,07 29,2±0,09 31±0,03 Ngày 3 29,4±0,07 31,2±0,15 29,1±0,12 30,9±0,03 29,1±0,13 30,8±0,15 Ngày 5 29,8±0,17 32±0,06 29,3±0,17 31,2±0,17 29,8±0,17 31±0,09 Ngày 7 28,5±0,06 30,3±0,17 28±0,09 30,3±0,33 28,2±0,17 31,8±0,17 Ngày 14 29,1±0,12 30,6±0,42 28,8±0,17 31,2±0,44 27,8±0,17 31,1±0,21
(Số liệu trình bày trung bình ± SE, n=3)
Như vậy sự chênh lệch nhiệt độ sáng, chiều ở các nghiệm thức tương đối giống nhau, chênh lệch lệch khơng quá 40C. Bức xạ mặt trời là nguyên nhân chính ảnh hưởng đến sự tăng hay giảm nhiệt độ, buổi chiều mặt nước hấp thụ nhiều bức xạ từ mặt trời nên nhiệt độ cao hơn là buổi sáng, trong thời gian thí nghiệm mưa nắng thất thường đây cũng là nguyên nhân làm chênh lệch nhiệt độ trong thời gian thí nghiệm.
Sự biến động nhiệt độ chung của các ruộng lúa ở ĐBSCL cĩ thể nằm ở mức 24 - 250C vào lúc 6 - 7 giờ sáng và đạt 340C vào thời điểm 2 - 3 giờ chiều (Vromant
31
et al., 2001). Như vậy sự biến động nhiệt độ trên ruộng lúa thí nghiệm nằm trong khoảng biến động nhiệt độ chung của ruộng lúa ở ĐBSCL. Cá rơ đồng sinh trưởng tốt ở khoảng nhiệt độ từ 20 - 300C (Baensch and Riehl, 1982). Nhiệt độ dao động trên ruộng trong thời gian thí nghiệm cao hơn khoảng nhiệt độ thích hợp cho cá rơ đồng, đây cũng cĩ thể là nguyên nhân làm tăng độc tính hĩa chất đến cá.
Cá rơ đồng (Anabas testudineus) là lồi kiếm ăn chủ động, cá thường sống ở mương và lên ruộng để tìm thức ăn, sinh sản. Khi gặp nhiệt độ cao cộng với thuốc BVTV sẽ gây hại cho cá. Đa số sinh vật, khi nhiệt độ tăng lên sẽ tăng cường trao đổi chất (Liu et al., 2000; Quin et al., 1997). Sự tăng cường cường độ trao đổi chất này nếu xảy ra trong mơi trường cĩ tồn tại hĩa chất thì sẽ làm tăng độc tính của hĩa chất đĩ và làm tăng sự xâm nhập độc chất vào cơ thể (Murty, 1988) nên cĩ khả năng tăng cường độc tính của Iprobenfos lên cá rơ đồng trong thí nghiệm. Theo Ngơ Tố Linh (2008), sự chênh lệch nhiệt độ (4 -100C), cĩ thể ảnh hưởng đến hoạt tính ChE cá rơ trong điều kiện tiếp xúc với hĩa chất. Trong thí nghiệm này sự biến động nhiệt độ từng nghiệm thức khơng quá 40C, biến động này cĩ thể ảnh hưởng đến hoạt tính ChE của cá rơ đồng trong thí nghiệm. Từ đĩ cĩ thể thấy, khi phun thuốc BVTV trên ruộng lúa sẽ tiềm ẩn khả năng gây hại cho cá rơ. Nếu phun thuốc với liều lượng cao cĩ thể gây chết cá hoặc ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển về sau của cá rơ.
b. Biến động DO ở ruộng thí nghiệm
DO là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của sinh vật. Nhìn chung DO cĩ sự biến động ở tất cả các nghiệm thức nhưng biến động khơng cao.
DO trong suốt thời gian thí nghiệm tương đối thấp. Sự chênh lệch DO thấp nhất và cao nhất ở các nghiệm thức nằm trong khoảng từ 0,83±0,08 mg/L đến 2,7±0,14 mg/L. Ở nghiệm thức đối chứng DO dao động trong khoảng 0,83 ± 0,08 mg/L đến 2,2±0,15 mg/L; ở ruộng từ 0,82±0,05 mg/L đến 2,3±0,28 mg/L; DO ở mương dao động từ 1,1±0,1 mg/L đến 2,66±0,14 mg/L. Chênh lệch cao nhất khơng quá 1,56 mg/L (Bảng 4.2).
DO buổi chiều luơn luơn cao hơn là buổi sáng ở tất các các thời điểm đo. DO cĩ sự liên quan mật thiết đối với cường độ quang hợp của thủy sinh vật và sự khuếch tán từ khơng khí vào nước. Đối với thủy vực nước động, DO chủ yếu được cung cấp bời sự khuếch tán là chủ yếu; đối với thủy vực nước tĩnh, DO được cung cấp chủ yếu từ quá trình quang hợp của thực vật thủy sinh. Ở ruộng thí nghiệm, ban đêm chỉ cĩ quá trình hơ hấp của sinh vật xảy ra nên hàm lương oxy hịa tan vào buổi sáng là chưa cao. Lượng oxy mà thực vật thủy sinh và tảo quang hợp tạo ra do cường độ ánh sáng tăng được tích lũy dần dần và đạt cực đại vào buổi chiều, thêm
32
vào đĩ hiện tượng khuếch tán từ khơng khí vào nước nhờ vào giĩ làm cho DO buổi chiều luơn cao hơn buổi sáng.
Bảng 4.2: DO (mg/L) trong thời gian thí nghiệm
Thời gian
Đối chứng Ruộng Mương bao
Sáng Chiều Sáng Chiều Sáng Chiều
Trước phun 0,94±0,1 1,47±0,13 1,1±0,06 2,2±0,14 1,2±0,03 2,66±0,14 Ngày 1 1,4±0,09 1,54±0,11 1,2±0,22 1,53±0,12 1,2±0,1 1,68±0,08 Ngày 3 1,2±0,12 1,54±0,12 1,1±0,15 1,84±0,17 1,2±0,14 2,2±0,07 Ngày 5 0,94±0,1 2,2±0,15 1,3±0,09 2,3±0,28 1,2±0,16 2,7±0,14 Ngày 7 0,83±0,08 1,39±0,08 0,82±0,05 1,46±0,19 1,1±0,1 2,09±0,34 Ngày 14 0,96±0,06 1,7±0,1 0,91±0,05 1,2±0,29 1,3±0,08 2,46±0,2
(Số liệu trình bày trung bình ± SE, n=3)
Trong điều kiện bình thường, DO khơng làm ảnh hưởng đến hoạt tính ChE (Nguyễn Văn Cơng và ctv., 2006b) nhưng khi giảm DO xuống mức 1,7 - 2,6 mg/L kết hợp với tăng nhiệt độ từ 200C lên 300C thì giá trị LC50 - 96 giờ của thuốc profenofos lên cá Pimephales promelas giảm từ 333 mg/L xuống 21,5 mg/L (Bear
et al., 2002). Khi DO giảm xuống thấp sinh vật sẽ gia tăng khả năng trao đổi nước qua mang, tăng cường hơ hấp khí trời,...quá trình này cĩ thể làm tăng cường độc tính của hĩa chất đối với sinh vật (Jensen et al., 1993). Đối với lồi cá cĩ khả năng hơ hấp khí trời thì sự biến động DO khơng tác động đến hoạt tính ChE nhưng sự chênh lệch nhiệt độ lớn (40C - 100C) cĩ thể ảnh hưởng đến hoạt tính ChE trong điều kiện tiếp xúc với độc chất (Ngơ Tố Linh, 2008). Cá rơ đồng (Anabas testudineus) là lồi hơ hấp khí trời bắt buộc, trong điều kiện bình thường lấy oxy từ khơng khí từ 30 - 70% nhu cầu cơ thể (Reddy and Natarajan, 1971) nên cĩ thể sống được trong mơi trường DO thấp và cũng hạn chế được sự xâm nhập của độc chất vào cơ thể hơn là hơ hấp trong nước. Mặc khác, Iprobenfos cĩ tác động trực tiếp, vị độc, xơng hơi nên hoạt động hơ hấp khí trời của cá rơ đồng cũng cĩ khả năng tăng cường hàm lượng độc chất xâm nhập vào cơ thể vào những ngày đầu khi phun thuốc.
c. Biến động pH ở ruộng thí nghiệm
Kết quả theo dõi diễn biến pH cho thấy, pH trong suốt thời gian thí nghiệm luơn nhỏ hơn 7, pH tương đối ổn định trong suốt thời gian thí nghiệm ở cả hai buổi sáng, chiều và cả ở các nghiệm thức. Ở nghiệm thức đối chứng pH cao nhất và thấp
33
nhất lần lượt là 6,39±0,06 và 6,08±0,04 chênh lệch 0,31 đơn vị; đối với nghiệm thức ruộng pH chênh lệch trong khoảng 6,14±0,06 đến 6,42±0,05 chênh lệch 0,28 đơn vị; ở nghiệm thức mương pH giao động từ 6,18±0,12 đến 6,45±0,05 chênh lệch 0,27 đơn vị. Chênh lệch pH giữa các nghiệm thức trong cùng một nghiệm thức khơng quá 0,5 đơn vị. Số liệu pH khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê (p>0,05) giữa hai buổi sáng, chiều ở từng nghiệm thức (Bảng 4.3).
Bảng 4.3: pH trong thời gian thí nghiệm
Thời gian
Đối chứng Ruộng Mương bao
Sáng Chiều Sáng Chiều Sáng Chiều
Trước phun 6,31±0,04 6,39±0,06 6,33±0,08 6,42±0,05 6,37±0,13 6,45±0,05 Ngày 1 6,14±0,07 6,38±0,11 6,37±0,14 6,29±0,03 6,35±0,16 6,23±0,07 Ngày 3 6,24±0,11 6,34±0,06 6,18±0,06 6,14±0,06 6,22±0,07 6,25±0,07 Ngày 5 6,08±0,04 6,25±0,07 6,2±0,06 6,17±0,09 6,18±0,12 6,2±0,07 Ngày 7 6,2±0,06 6,24±0,02 6,2±0,02 6,25±0,02 6,2±0,02 6,42±0,15 Ngày 14 6,11±0,04 6,36±0,07 6,15±0,04 6,41±0,03 6,2±0,08 6,29±0,04