b. Hoạt chất Iprobenfos
2.6. Một số nghiên cứu về ảnh hưởng của thuốc bảo vệ thực vật đến enzyme
enzyme Cholinesterase
Fulton et al., (2001) đã đã nghiên cứu sử dụng sự ức chế ChE ở cá và động vật khơng xương sống vùng cửa sơng như một chỉ thị cho việc phơi nhiễm thuốc trừ sâu nhĩm lân hữu cơ. Tác giả chỉ ra ngưỡng chịu đựng ức chế ở các lồi khác nhau là khơng giống nhau, một số lồi cá cĩ thể chịu đựng được mức ức chế rất cao mà khơng gây chết.
Nguyễn Văn Cơng và Nguyễn Thanh Phương (2011) nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc bảo vệ thực vật chứa hoạt chất diazinon đối với cá lĩc (Channa striata) đã được phát hiện bao gồm: ức chế enzyme cholinesterase, làm giảm tăng trưởng, gia tăng tập tính đớp khí và cĩ khả năng gây chết cá con khi nĩ được sinh sản trên ruộng.
Trần Sỹ Nam và ctv., (2012), cũng đã nghiên cứu trên cá rơ đồng về ảnh hưởng của alpha - cypermethrin lên enzyme cholinesterase và sinh trưởng của cá rơ đồng (Anabas testudineus). Kết quả nghiên cứu cho thấy alpha-cypermethrin rất độc đối với cá rơ đồng, giá trị LC50-96 giờ là 10,49 µg/L. Hoạt tính ChE bị ức chế lần lượt là 5,3%; 36,1%; 39,8% so với đối chứng với các mức nồng độ alpha- cypermethrin (0,105%; 1,049% và 2,623% µg/L) sau khi tiếp xúc với thuốc alpha- cypermethrin 36 giờ.
Võ Thị Yến Lam và Nguyễn Văn Cơng (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc trừ sâu chứa hoạt chất fenobucard phun cho lúa ở Hậu Giang lên cá Lĩc (Channa striata). Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng, nồng độ fenobucard trên ruộng sau khi phun 1 giờ dao động từ 0,014 đến 0,291 mg/L và hầu hết giảm xuống dưới ngưỡng phát hiện (0,05 µg/L) sau 1 ngày phun thuốc. ChE bị ức chế cao nhất sau 1 ngày phun và phục hồi hồn sau 5 ngày phun.
Nguyễn Khắc Du (2010) đã sử dụng enzyme ChE để đánh giá ảnh hưởng của Isoprocard lên cá rơ đồng (Anabas testudineus) giống và nghiên cứu của Trần Văn Thạnh về độc cấp tính của hỗn hợp diazinon và fenobucard lên cá rơ đồng (Anabas testudineus). Kết quả hỗn hợp chứa 30% diazinon và 20% fenobucard ít độc đối với cá rơ đồng và giá trị LC50-96 giờ của hỗn hợp này là 30,4 mg/L. Sự phối trộn này làm giảm độc tính đối với cá rơ đồng hơn là từng hoạt chất riêng lẽ. Ở mức nồng độ 1% LC50-96 giờ (0,3 mg/L) của hỗn hợp này đã làm ức chế ChE 60% sau 6 giờ tiếp xúc với thuốc và cĩ dấu hiệu phục hồi ChE trong não sau 72 giờ. Cá phục hồi nhanh khi được thay nước sạch, sau 14 ngày sẽ phục hồi hồn tồn.
Ngơ Tố Linh, 2008. Nghiên cứu ảnh hưởng của diazinon lên enzyme cholinesterase ở cá rơ đồng (Anabas testudineus). Kết quả cho thấy, nồng độ diazinon trong nước ở ruộng sau 1 giờ phun dao động từ 8 – 711 µg/L và dưới
21
ngưỡng phát hiện (< 0,3 µg/L) trong vịng 3 – 5 ngày. Hoạt tính ChE trong não và thịt bị ức chế từ 30 – 85% và phục hồi sau 2 tuần phun diazinon. Hoạt tính ChE trong não và thịt đều nhạy cảm với thuốc trừ sâu gốc Lân hữu cơ.
22
CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
Thí nghiệm được bố trí ở ruộng lúa của nơng dân Nguyễn Văn Ni ở khu vực Thới An, phường Thới An, quận Bình Thủy, thành phố Cần Thơ. Mẫu được phân tích tại phịng thí nghiệm Khoa Mơi trường và Tài nguyên Thiên nhiên, Đại học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 7 đến tháng 11 năm 2014.
3.2 Sinh vật thí nghiệm
Cá rơ đồng (Anabas testudineus) cỡ giống cĩ trọng lượng 4,31 ± 0,6 g (TB ± SD, n=30), được mua tại trại cá giống ở Quận Ơ Mơn - TP Cần Thơ và được thuần dưỡng trong ao nước sạch, nơi khơng cĩ phun thuốc BVTV. Trước khi bắt đầu thí nghiệm cá được thuần dưỡng trong lồng lưới khoảng 1 tuần, được cho ăn bằng thức ăn viên 2 lần/ngày (cơng ty Grobest Việt Nam sản xuất, chứa 30% đạm). Lượng thức ăn cho ăn khoảng 3 - 5% trọng lượng cá.
Hình 3.1: Cá rơ đồng dùng trong thí nghiệm
3.3 Hĩa chất và dụng cụ, thiết bị trong nghiên cứu 3.3.1 Hĩa chất nghiên cứu 3.3.1 Hĩa chất nghiên cứu
a. Thuốc BVTV chứa hoạt chất Iprobenfos
23
Thuốc BVTV KiSaiGon 50ND chứa 50% hoạt chất Iprobenfos (O , O - bis ( 1-metyletyl) S - ( phenylmethyl ) phosphorothioate) thuộc nhĩm Lân hữu cơ do cơng ty cổ phần Bảo vệ thực vật Sài Gịn sản xuất. Thuốc cĩ dạng nhũ dầu, liều lượng được khuyến cáo sử dụng trên lúa là 1 - 2 lít/ha.
b. Hĩa chất phân tích ChE
- Các hĩa chất sử dụng để phân tích ChE bao gồm: Na2HPO4.2H2O (Merck); NaH2PO4.2H2O (Merck) dùng để pha dung dịch pH=7,4 và pH=8.
- C14H8N2O8S2 (5,5’ - dithio – bis - 2 - nitrobenzoic acide) cịn gọi là DTNB (Merck) và Acetylcholinesterase iodide (Merck) dùng để đo ChE.
c. Hĩa chất trong phân tích Iprobenfos
- Iprobenfos chuẩn sử dụng từ hoạt chất Iprobenfos 99,6% (Germany) dùng để tạo đường chuẩn trong phân tích sắc ký.
- Các dung mơi acetone 99,7% (Merck), Toluene 99,9% (USA), Hexanes 95% (USA), Methanol 99,8% (Merck) dùng trong ly trích thuốc BVTV.
3.3.2 Dụng cụ, thiết bị
a. Thiết bị đo trực tiếp tại hiện trường
Máy đo DO (Hanna HI 9146, Romania), pH (pIONneer 10), nhiệt kế được sử dụng để đo oxy hịa tan, pH và nhiệt độ mơi trường nước trong thời gian thí nghiệm.
b. Đo enzyme
- Cân điện tử (Sartorius, BP410S, Đức); bộ dao mổ; cối nghiền được dùng cho quá trình cân, mổ, nghiền não cá.
- Pipet dùng để hút mẫu, dung dịch; enpendoft dùng để chứa mẫu não đã nghiền và ly tâm.
- Máy ly tâm HSIANGTAI CM-610 được dùng để ly tâm mẫu sau khi nghiền.
- Máy so màu quang phổ (U2800-Hitachi, Nhật) dùng để đo hoạt tính ChE. - Tủ đơng SANAKY VN-285A, tủ lạnh TOSHIBA (Nhật) được dùng để trữ mẫu.
c. Đo Iprobenfos
- Máy GCMS-QP2010 dùng trong phân tích mẫu thuốc.
24
- Bộ hút chân khơng (ASPIRATOR A-3S), giấy lọc Cellulose Acetate filter lỗ lọc 0,45 µmdùng trong việc loại bỏ chất rắn lơ lững trong mẫu nước.
- Cột lọc Superclean LC-18 SPE 500 mg (Supelco, USA) dùng để lọc mẫu chứa thuốc.
d. Dụng cụ bố trí thí nghiệm ngồi đồng ruộng
Lồng lưới để bố trí thí nghiệm ngồi ruộng lúa, kích thước: dài, rộng, cao lần lượt là 0,5x0,4x0,5 m. Cĩ 9 lồng, được làm bằng khung sắt và được bao lưới xung quanh.
3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Bố trí thí nghiệm 3.4.1 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí ở 2 ruộng lúa ở Quận Bình Thủy, thành phố Cần Thơ. Ruộng thí nghiệm cĩ diện tích là 900 m2, vị trí tiếp giáp với kênh, lộ, vườn trái cây, mặt cịn lại tiếp giáp với ruộng khác; cĩ mương bao 2 mặt của ruộng. Ruộng đối chứng cĩ diện tích là 1.350 m2 các mặt tiếp giáp với lộ, vườn trái cây và 2 mặt cịn lại tiếp giáp với ruộng khác.
Đặt 3 lồng bằng lưới cĩ kích thước (0,5x0,4x0,5 m) trên ruộng lúa và 3 lồng lưới (0,5x0,4x0,5 m) trên mương (Hình 3.3). Thả 30 cá vào mỗi lồng 1 tuần rồi cung cấp thuốc KiSaiGon 50ND (chứa 50% hoạt chất Iprobenfos) cho nơng dân phu theo liều lượng chỉ dẫn ghi trên nhãn chai, khi lúa được 45 ngày tuổi. Ruộng chỉ được phun 1 lần trong thời gian thí nghiệm.
Hình 3.3: Sơ đồ vị trí đặt các lồng cá
Nghiệm thức đối chứng được bố trí ngồi ruộng lúa bằng lồng lưới, 3 lồng lưới được đặt theo đường chéo của ruộng, kích thước tương tự như các lồng khác, nơi khơng cĩ phun hố chất Iprobenfos.
L3
L2
L1 L4
L5 L6
25
Hình 3.4: Vị trí đặt các lồng cá trên ruộng và mương
3.4.2 Xác định dư lượng hĩa chất Iprobenfos trong nước a. Thu và bảo quản mẫu a. Thu và bảo quản mẫu
Mẫu nước được thu ở các thời điểm: trước khi phun thuốc, sau khi phun 1 giờ và 1, 3, 7, 14 ngày sau khi phun để phân tích nồng độ hoạt chất Iprobenfos. Mẫu nước được thu trong chai nhựa, thể tích thu là 500 mL, thu mẫu nước ở từng vị trí đặt lồng cá, mỗi vị trí thu 2 chai cho 1 lần thu.Mẫu nước được trữ lạnh ngay sau khi thu và trữ đơng ở phịng thí nghiệm cho đến khi phân tích. Hàm lượng Iprobenfos trong mẫu nước được phân tích tại phịng thí nghiệm Khoa Mơi Trường và Tài Nguyên Thiên Nhiên, Đại học Cần Thơ.
b. Phương pháp ly trích thuốc BVTV từ nước
Mẫu nước sau khi được thu trực tiếp từ ruộng sẽ được lọc qua giấy lọc cĩ kích thước lỗ là 0,45 µm để loại bỏ chất rắn lơ lửng, mẫu nước sau khi lọc xong sẽ cho vào 15 % NaCl vào.
Tiếp theo là hoạt hĩa cột lọc Superclean LC-18 SPE bằng 2 mL methanol và 2 ml nước cất. Sau khi hoạt hĩa cột lọc, cho mẫu qua cột lọc để hấp phụ Iprobenfos. Bước tiếp theo là rửa giải cột lọc bằng acetone.
Dung dịch sau khi rữa giải được cơ đặc bằng cách thổi khí nitơ đến khi gần cạn và ngừng thổi khí, sau đĩ cho dung dịch vừa cơ cạn vào vial khoảng 1ml để phân tích bằng máy GCMS – QP 2010. NT2 NT3 NT5 NT6 NT1 NT4
26
Hình 3.5: Sơ đồ ly trích Iprobenfos trong nước
c. Phương pháp phân tích Iprobenfos bằng máy GCMS – QP2010
Phân tích được thực hiện bằng cách sử dụng hệ thống GC - MS QP 2010 trang bị 1 mẫu tự động AOC - 20i Shimadzu và cột mao quản Silica DB - 5ms (30 m x 0,25 mm id., độ dày 0,25 µm, from J&W scientific, Folsom, CA, USA). Chương trình nhiệt trong quá trình phân tích được thiết lập như sau: 2 phút đầu ổn nhiệt ở 700C và sau đĩ nhiệt độ tăng lên 1500C với tốc độ 180C/phút và giữ trong 1 phút, sau đĩ tăng đến 2000C với tốc độ 30C/phút và cuối cùng tăng đến 2800C với tốc độ 80C/phút và được giữ trong 15 phút. Khí mang sử dụng là Helium với tốc độ dịng 1 ml/phút. Thể tích tiêm mẫu là 1 µL. Ba mảnh ion được cài đặt để theo dõi cho hợp chất là 204, 123 và 288. Thời gian lưu cho hoạt chất Iprobenfos trong thí nghiệm này được xác định là ở phút thứ 20,15 sau khi tiêm mẫu.
Lọc mẫu nước qua giấy lọc 0,5 µm
Hoạt hĩa cột Superclean LC – 18 SPE Cho mẫu nước qua cột
C18
Làm khơ cột C18 Rửa cột C18 Bay hơi mẫu
GCMS Cho vào Vial
27
Hình 3.6: Máy sắc ký phối phổ GCMS và hoạt hĩa cột lọc
Hình 3.7: Sắc ký đồ chạy chuẩn Iprobenfos (5 mg/L) bằng GCMS
3.4.3 Xác định ảnh hưởng của Iprobenfos lên hoạt tính enzyme Cholinesterase a. Thu mẫu và bảo quản a. Thu mẫu và bảo quản
Mẫu cá được thu tại các thời điểm: 1 ngày trước khi phun thuốc, và 1, 3, 5, 7, 14 ngày sau khi phun để phân tích ChE trong não cá.
Mỗi lần thu 18 cá (2 cá/lồng cho 9 lồng, kể cả đối chứng). Sau khi bắt, cá được giết bằng cách đưa vào nước đá và được chuyển về phịng thí nghiệm, sau đĩ mổ lấy não cho vào từng enpendoft đã đánh dấu riêng biệt, nghiền, trữ lạnh và phân tích ngay bằng máy so màu quang phổ.
Các yếu tố như: mực nước, nhiệt độ, oxy, pH được đo 2 ngày/lần vào lúc 7:00 - 7:30 và 14:00 - 14:30 tại các địa điểm đặt lồng cá.
28
Cá được giết bằng nước đá sau đĩ dùng kéo cắt dọc hai bên mang cá để lộ hộp sọ; tiếp tục dùng kéo cắt dọc hai bên hộp sọ, bắt đầu từ mắt đến giáp giữa xương sống và hộp sọ, cắt ngang hộp sọ giữa hai mắt cá và cắt ngang hộp sọ với xương sống dùng kẹp lấy lớp xương vừa cắt ra, não cá sẽ lộ ra và khi đĩ dùng kẹp gắp não ra cho vào enpendoft được giữ lạnh. Sau đĩ cân trọng lượng não cá.
Hình 3.8: Mổ lấy não và nghiền não cá
c. Phân tích ChE
Mẫu não được nghiền riêng biệt trong dung dịch đệm 0,1 M phosphate buffer pH 7,4 bằng cối nghiền. Thể tích dung dịch đệm cho vào đảm bảo tất cả các não đều cĩ nồng độ 20 mg não/mL dung dịch đệm pH 7,4. Sau mỗi lần nghiền, rửa dụng cụ nghiền bằng nước cất – acetone – nước cất. Mẫu được trộn đều, lấy 1ml dung dịch này cho vào enpendoft rồi đem ly tâm ở tốc độ 2000 vịng/phút trong 20 phút. Phần trong phía trên mẫu ly tâm được lấy ra đo ChE.
ChE được đo bằng máy so màu quang phổ ở bước sĩng 412 nm trong 200 giây dựa theo phương pháp Ellman et al., (1961). Mỗi mẫu đo được chuẩn bị bằng cách cho 2,65 mL 0,1 M Phosphate bufer pH 7,4 vào cuvest nhựa (cĩ thể làm cho nhiều cuvest), tiếp tục cho 0,1 mL dung dịch 3mM DTNB và 0,05 mL dung dịch 10 mM Acetylthiocholine iodide. Sau đĩ, cho 0,2 mL dung dịch mẫu não đã ly tâm vào và bắt đầu đo. Mẫu trắng cũng cĩ hĩa chất tương tự như mẫu đo ChE nhưng lấy 0,2 mL dung dịch đệm 0,1 M phosphate pH 7,4 thay cho dung dịch mẫu não. Kết quả được ghi nhận khi hệ số tương quan (r2) đạt từ 0,9 trở lên.
3.4.4 Phương pháp tính tốn a. Xử lý kết quả a. Xử lý kết quả
Hoạt tính enzyme ChE:
HT= s v v v xP ExLxS xH AxC
29 Trong đĩ:
+ HT (hoạt tính): µmol/g/phút
+ A: Abs mẫu - Abs blank (Abs/phút)
+ Cv: thể tích cuvest hay tổng thể tích dung dịch đo (mL) = 3 mL + Hv: thể tích buffer sử dụng để nghiền mẫu
+ E: hệ số =13,6
+ L: chiều dài cuvet (cm) =1 cm
+ Sv: thể tích mẫu sau ly tâm lấy đo (mL) = 0,2 mL + Ps: trọng lượng mẫu lấy nghiền (g)
Tỷ lệ ức chế TLUC =100 – 100 ChEtbdc ChEs Trong đĩ: + TLUC: tỉ lệ ức ChE bị ức chế (%)
+ ChEs: là hoạt tính ChE đo được từng mẫu (µmol/g/phút)
+ ChEtbdc: là hoạt tính ChE trung bình của nghiệm thức đối chứng ở từng thời điểm (µmol/g/phút)
b. Xử lý số liệu
Các số liệu thơ về hoạt tính ChE và nồng độ Iprobenfos được kiểm tra tính đồng nhất của phương sai và phân phối chuẩn trước khi thực hiện các phép thống kê. Số liệu phân phối chuẩn sẽ được phân tích phương sai (ANOVA) và so sánh trung bình ChE các nghiệm thức với đối chứng bằng kiểm định Dunnett. So sánh khác biệt các chỉ tiêu ở các thời điểm trong cùng 1 nghiệm thức bằng kiểm định Duncan. Kiểm tra sự khác biệt nồng độ Iprobenfos giữa 2 nghiệm thức ruộng, mương ở từng thời điểm bằng kiểm định T Test thơng qua sử dụng IBM SPSS Statistics 20. Sai khác cĩ ý nghĩa thống kê ở mức 95% (p<0,05).
30
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nhiệt độ, pH, DO và mực nước trong thời gian thí nghiệm a. Biến động nhiệt độ ở ruộng thí nghiệm
Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến đến sinh trưởng và phát triển của sinh vật. Trong thí nghiệm này, nhiệt độ biến động cao nhất và thấp nhất ở 3 nghiệm thức đối chứng, ruộng, mương nằm trong khoảng từ 28±0,090C đến 32±0,060C. Ở từng nghiệm thức cĩ sự chênh lệch nhiệt độ giữa hai buổi sáng và chiều ở tất cả các ngày đo, nhiệt độ buổi chiều luơn luơn cao hơn buổi sáng. Trung bình nhiệt độ ở ruộng đối chứng dao động thấp nhất và cao nhất trong khoảng từ 28,5±0,06 (buổi sáng 7 - 8 giờ) đến 32±0,060C (buổi chiều 14 - 15 giờ), chênh lệch 3,50C. Nhiệt độ ở ruộng giữa 2 buổi sáng, chiều dao động trong khoảng 28±0,090C đến 31,5±0,090C, chênh lệch 3,50C; trong khi đĩ ở mương bao dao động từ 27,8±0,17 đến 31,8±0,170C, chênh lệch 40C (Bảng 4.1).
Bảng 4.1: Nhiệt độ (0C) trong thời gian thí nghiệm
Thời gian
Đối chứng Ruộng Mương bao
Sáng Chiều Sáng Chiều Sáng Chiều
Trước phun 29,2±0,09 31,1±0,06 29,2±0,17 31,5±0,29 29±0,06 31±0,09 Ngày 1 29,5±0,06 31,1±0,13 29,1±0,07 30,9±0,07 29,2±0,09 31±0,03 Ngày 3 29,4±0,07 31,2±0,15 29,1±0,12 30,9±0,03 29,1±0,13 30,8±0,15 Ngày 5 29,8±0,17 32±0,06 29,3±0,17 31,2±0,17 29,8±0,17 31±0,09 Ngày 7 28,5±0,06 30,3±0,17 28±0,09 30,3±0,33 28,2±0,17 31,8±0,17 Ngày 14 29,1±0,12 30,6±0,42 28,8±0,17 31,2±0,44 27,8±0,17 31,1±0,21
(Số liệu trình bày trung bình ± SE, n=3)
Như vậy sự chênh lệch nhiệt độ sáng, chiều ở các nghiệm thức tương đối giống nhau, chênh lệch lệch khơng quá 40C. Bức xạ mặt trời là nguyên nhân chính ảnh hưởng đến sự tăng hay giảm nhiệt độ, buổi chiều mặt nước hấp thụ nhiều bức xạ từ mặt trời nên nhiệt độ cao hơn là buổi sáng, trong thời gian thí nghiệm mưa nắng thất thường đây cũng là nguyên nhân làm chênh lệch nhiệt độ trong thời gian thí nghiệm.