- Cố định tế bào trên các lam bằng cồn tuyệt đối, để khô tự nhiên.
- Nhỏ thuốc nhuộm Giemsa lên mặt lam kính, để 15 phút, rửa, để khô tự nhiên. - Xác định tỷ lệ tế bào chuyển dạng trên kính hiển vi với độ phóng đại 10x100. - Tỷ lệ tế bào chuyển dạng là số tế bào chuyển dạng trên 100 tế bào được đếm.
- Các mẫu nước nổi nuôi cấy tế bào bảo quản ở -70°c được để tan tự nhiên ở nhiệt độ thường trước khi định lượng.
- Cytokin trong môi trường nuôi cấy được định lượng bằng kỹ thuật miễn dịch hấp phụ enzyme, ELISA (Enzym linked immunosorbant assay).
- Các bước định lượng được tiến hành theo quy trình định lượng của hãng. Nguyên tác kỹ thuât ELISA đinh lương cvtokin
Phản ứng ELISA định lượng cytokin được tiến hành theo kỹ thuật Sandwich ứng dụng để định lượng cytokin trong huyết thanh, dịch nuôi cấy tế bào và các dịch sinh học khác. Kháng thể đơn dòng kháng cytokin được gắn trên pha rắn (thành giếng định lượng). Kháng nguyên cytokin trong môi trường nuôi cấy gắn đặc hiệu với kháng thể trên pha rắn, sau khi rửa, cho thêm kháng thể thứ 2 gắn Biotin tạo thành phức hợp KT-KN-KT-Biotin. Enzym oxy hóa được gắn lên phức hợp thông qua liên kết Biotin-Streptavidin tạo phức hợp KT-KN-KT-Biotin- Streptavidin-HRP (Horse Radish Peroxydase) gắn trên thành ống nghiệm. Phức hợp được phát hiện nhờ phản ứng giữa cơ chất và TMB (TetraMethylBenzidine) tạo sản. phẩm màu xanh, chuyển thành màu vàng ở môi trường acid. Đo quang ở bước sóng 450nm, cường độ màu tỷ lệ với lượng cytokin cần xác định trong dịch nuôi cấy tế bào.
Kit được sử dụng để định lượng IL-4, IL-10, IFNy là các kit có độ nhạy cao (high sensitivity), sử dụng chất mang là Amdex, một chất được cấu tạo bởi một chuỗi Dextran mạch thẳng có gắn hàng trăm phân tử HRP và khoảng 10 phân tử Streptavidine. Amdex cho phép phát hiện các cytokin ở nồng độ rất thấp nhờ khả năng khuyếch đại tín hiệu.
Hình 2.2. Nguyên tắc kỹ thuật ELISA
1: pha rắn ị thành giếng định lượng) 2: kháng thể thứ nhất gắn lên pha rắn 3: kháng nguyên (cytokin)
4: kháng thể thứ hai gắn biotin 5: biotin
6: streptavidin
7: men oxy hóa 8: đo quang
Định lượng IL-4, IL-10, IFNy được tiến hành theo kỹ thuật Sandwich 2 giai đoạn với các kit có độ nhạy cao của hãng Amersham Biosciens. IL-2 được định lượng bằng kỹ thuật Sandwich 1 giai đoạn của cùng hãng Amersham Biosciens .
Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê y học vói sự trợ giúp của phần mềm SPSS 10.0
- Thống kê mô tả được biểu diễn dưới dạng trung bình ±độ lệch chuẩn đối với các biến số phân bố chuẩn, trung vị (median) đối với các biến số không tuân theo phân bố chuẩn, giá trị lớn nhất, giá trị nhỏ nhất, tỷ lệ phần trăm.
- So sánh giá tri trung bình của các mẫu sử dụng test T Student đối với các biến phân bố chuẩn, sử dụng test u Mann-Whitney với số liệu không tuân theo phân bố chuẩn.So sánh các tỷ lệ sử dụng test %2.
- Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05
Từ tháng 6 năm 2002 đến tháng 4 năm 2003 có 21 bệnh nhân và 12 người bình thường khoẻ mạnh tham gia vào nghiên cứu, trong đó có 4 bệnh nhân bị loại khỏi nhóm nghiên cứu do phải truyền máu trong quá trình phẫu thuật.
3.1. Đặc điểm của nhóm bệnh và nhóm chứng
Hai nhóm nghiên cứu đã được khảo sát về đặc điểm dịch tễ học (bảng 3.1) và các thông số miễn dịch trong máu ngoại vi (bảng 3.2).
PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Bảng 3.1. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân và nhóm chứng Bệnh nhân (n=17) Nhóm chứng (n=12) p Tuổi 50,7+2,4.(24-5-70) 48,4+3,7 (41 - 57) 0,765* Giới Nam 12 (70,6 %) 8 (66,7 %) 0,822** Nữ 5 (29,4 %) 4(33,3 %) Vị trí u Đại tràng 7 (41,2%) Trực tràng 10 (58,8%) Giai đoạn Duke A-B 7 (41,2%)
bệnh Duke c 10 (58,8%)
* So sánh sử dụng test T Student. ** So sánh sử dụng test khi bình phương Nhân x ét:
- Sự phân bố theo tuổi và giói giữa nhóm bệnh và nhóm chứng là tương đối đồng đều và khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
- Trong số 17 bệnh nhân nghiên cứu có 10 bệnh nhân ung thư trực tràng (58,8%) và 7 bộnh nhân ung thư đại tràng (41,2%) bao gồm 1 ung thư đại tràng trái, 2 ung thư đại tràng phải và 4 ung thư đại tràng sigma.
- Có 1 bệnh nhân ở giai đoạn Duke A; 6 bệnh nhân ở giai đoạn Duke B và 10 ở giai đoạn Duke c.
Bảng 3.2. Các thông số miễn dịch trong máu ngoại vi Bệnh nhân (n=17) Nhóm chứng (n=12) p Bạch cầu (106 tb/cm3) 8,5 ±3,8 (4,6 4-16,7) 7,2 ±2,1 (4,4+ 9,8) 0,304* Tỷ lệ lymphocyte (%) 23,9 ± 9,8 (11 -ỉ- 50,3) 29,8 ±8,3 (17,3-46,7) 0,109* Số lượng lymphocyte (106 tb/cm3) 2,1 ±0,7 (1,3-3,9) 2,2 ±1,1 (1,1 4,4) 0,618* CEA (ng/ml) 4(1-177)** - - * So sánh sử dụng test T Student
** Nồng độ CEA trong máu không tuân theo phân bố chuẩn nên được biểu diễn theo trùng vị của mẫu. Tri số trong ngoặc là giá tri lớn nhất và nhỏ nhất của mẫu. Nhân x é t: Các kết quả ở bảng 3.2 cho thấy
- Số lượng bạch cầu ở nhóm bệnh nhân hơi cao hơn nhóm chứng (8,5 so với 7,2) tuy nhiên tỷ lệ lymphocyte lại thấp hơn so với nhóm chứng (23,9% với 29,8%). Số lượng lymphocyte ờ hai nhóm tương đương nhau và khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
- Nồng độ CEA trong máu bệnh nhân phân bố tương đối rộng (1 H-177), 11 bệnh nhân (64,7%) có nồng độ CEA < 10ng/ml, 6 bệnh nhân (35,3%) có nồng độ CEA
tăng cao >10 ng/ml.
3.2. Tỷ lệ chuyển dạng tế bào lympho sau 48 giờ nuôi cấy
Sau 48 giờ nuôi cấy, tế bào PBMC trong 3 giếng của mỗi lô được gộp chung lại, nhỏ trên lam kính, để khô rồi nhuộm Giemsa. Tế bào chuyển dạng được quan sát và xác định trên kính hiển vi với độ phóng đại 100x10 (hình 3.1), đó là các tế bào lớn hơn tế bào bình thường, có thể quan sát thấy nhiều hạt trong bào tương. Tỷ lộ tế bào chuyển dạng là số tế bào chuyển dạng trong số 100 tế bào được đếm.
Bảng 3.3. Tỷ lệ chuyển dạng tế bào của PBMC sau 48h nuôi cấy (%)
Lô 1 Lô 2
PHA 3|ig/ffil PHA 3|Ẳg/ml+Aslem 0,15|j.g/ml Bệnh nhân (n=17) (1) 21,6±7,8 (11 -ỉ- 38) (3) 33,6± 8,2 (21 - 56) Nhóm chứng (n=12) (2) 26,7±5,9 (18-Ỉ-40) (4) 36,3±7,5 (26-54) p 1_2= 0,05 p J.3 < 0,001 ỹ 3A = 0,367 p 2.4 = 0,002
* Kết quả trong bảng là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (nhỏ nhất -ỉ- lớn nhất), so sánh 2 giá trị trung bình theo test T Student.
Nhân x ét:
- Đáp ứng chuyển dạng ở nhóm bệnh có xu hướng thấp hơn so vói nhóm chứng khi không có Aslem trong môi trường nuôi cấy (Pj.2 = 0,05).
- Đáp ứng chuyển dạng ở cả nhóm bệnh và nhóm chứng khi có Aslem cao hơn có ý nghĩa so với không có Aslem (p !_3< 0,001 ở nhóm bệnh, p 2-4 = 0,002 ở nhóm
chứng).
- Đáp ứng chuyển dạng ở nhóm bệnh thấp hon không có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng trong môi trường có Aslem (p 3.4= 0,367).
3.3. Nồng độ cytokin trong nước nổi nuôi cấy
Các cytokin được lựa chọn trong nghiên cứu này là IL-2, IFNy, IL-4, IL-10, được định lượng theo kỹ thuật Sandwich một và hai giai đoạn, sử dụng kit của Amersham Biosciens.
Nồng độ các cytokin trong môi trường nuôi cấy phân bố khá rộng, không tuân theo phân bố chuẩn. Vì vậy, chúng tôi sử dụng giá trị trung vị để đại diện cho mẫu. Các phép so sánh sử dụng test u Mann Whitney.
Nồng độ cytokin type I trong các môi trường nuôi cấy được thể hiện qua bảng 3.4 và 3.5.
Bảng 3.4. Nồng độ EL-2 (pg/ml) trong môi trường nuôi cấy tế bào
Lô 1 Lô 2
PHA 3ịj.g/ml PHA 3|ig/ml +Aslem 0,15|ig/ml Bệnh nhân (n=17) (1) 98,4 (51,1-5-132) (3) 105,6 (52,0 H-129,3) Nhóm chứng (n=12) (2) 104,3 (80,2-5-125,6) (4) 114,3 (56,6-ỉ-123,8) p !_2= 0,18 p 1-3 = 0,563 p 3-4 = 0,74 p 2.4 = 0,298 Nhân x é t:
I
vói nhóm chứng (98,4 so với 104,3), p !_2 = 0,18.
- Sự khác biệt về nồng độ IL-2 khi có Aslem và không có Aslem ở cả nhóm bệnh và nhóm chứng đều không có ý nghĩa thống kê (p J.3 = 0,563 vói nhóm bệnh, p 2_4= 0,298 với nhóm chứng).
Bảng 3.5. Nồng độ IFNy (pg/ml) trong môi trường nuôi cấy tế bào
Lô 1 Lô 2
PHA 3ịig/ml PHA 3ịj.g/ml +Aslem 0,15ịu.g/ml Bệnh nhân (n=17) (1) 68,2 (43,3 - 1983,1) (3) 64,3 (45,5-2126,2) Nhóm chứng (n=12) (2) 70,8 (48,1-292,0) (4) 57,7 (52,5 4-132,8) p 1-2= 0,948 p 1-3 = 0,683 p 3.4 = 0,347 p 2-4 = 0,887 Nhân x é t:
- Khi không có Aslem, chúng tổi không thấy có sự khác biệt về nồng độ IFNy giữa nhóm bệnh và nhóm chứng, p ^2= 0,948.
- Sự khác biệt về nồng độ IFNy khi có và không có Aslem ở cả nhóm bệnh và nhóm chứng đều không có ý nghĩa thống kê (Pj.3 = 0,683 với nhóm bệnh, p2-4= 0,887 với nhóm chứng).
# 0 % A % ® 0 0
Hình 3.1. Hình ảnh chuyển dạng tế bào lympho.
• Cấc tế bào đánh số 1 được đọc là chuyển dạng.
Phân bố nồng độ IL-2 và IFNy được mô tả trong hình 3.2. Gạch ngang thể hiện giá trị trung vị của mẫu.
IL-2 (ịỊgảul) IL-2 (pg.mi)
140 °"1 NUóm clxứu.2 50.D- 0 J ữ ' « Aslem(-) ÀsleiìiB*) IFN gaaiuia (p$/ml) 2mô-r 2000.0- 1500.0' Bệtili alỉáa Asleiii(-) Asleiu.(+)
IFN gamma (pg/uxi)
ÍS0.0'
Niióm cliứua;
V"0JI
AsleuU -) AslemH)
Hình 3.2. Nồng độ IL-2 và IFNy trong nước nổi nuôi cấy PBMC
Xu hướng tác dụng của Aslem lên sự chế tiết cytokin được đánh giá thông qua sự tăng giảm nồng độ cytokin trong môi trường nuôi cấy có Aslem so với không có Aslem. Bảng 3.6 thể hiện xu hướng biến đổi nồng độ cytokin type I dưới tác dụng của Aslem theo số lượng và tỷ lệ (%) cắc mẫu biến đổi.
Bảng 3.6. Xu hướng biến đổi nồng độ cytokin type I dưói tác dụng của Aslem Xu hướng biến đổi IL-2 IFNy n % n % Bệnh nhân n=17 Tăng 7 41,2 6 35,3
Không thay đổi 5 24,9 9 52,9
Giảm 5 24,9 2 11,8
Nhóm chứng n=12
Tăng 7 58,3 4 33,3
Không thay đổi 2 16,7 2 16,7
Giảm 3 25 6 50
Theo quv ước chung trong miễn dịch học, nồng độ cytokin biến đổi > 10% được coi là có ý nghĩa, chênh lệch nồng độ nhỏ hơn 10% được coi là không thay đổi. Nhân x é t:
- Trong số 17 mẫu nuôi cấy PBMC của bệnh nhân ung thư ĐTT, Aslem làm tăng chế tiết JL-2 ở 7 mẫu (41,2%) và tăng IFNy ở6 mẫu (35,3%).
- Trong số 12 mẫu nuôi cấy PBMC của người khỏe mạnh, Aslem làm tăng chế tiết IL-2 ở 7 mẫu (58,3%) và tăng IFNy ở 4 mẫu (33,3%)-
- Có một số mẫu không đáp ứng vói Aslem và một số mẫu giảm chế tiết IL-2, IFNy khi có thêm Aslem trong môi trường nuôi cấy.
Nồng độ cytokin type n trong các môi trường nuôi cấy được thể hiện qua bảng 3.7 và 3.8 .
Bảng 3.7. Nồng độ IL-4 (pg/ml) trong môi trường nuôi cấy tế bào
Lô 1 Lô 2
PHA 3ịj.g/ml PHA 3ịig/ml +Aslem 0,15p,g/ml Bệnh nhân (n=17) (1) 40,2 (32,7-5-47,2) (3) 37,4 (28,1 - 215,7) Nhóm chứng (n=12) (2) 36 (27,1-48,1) (4) 36,5 (26,7 225,5) Pl.2= 0,069 p 1.3 = 0,150 p3_4= 0,556 p 2-4 = 0,799 Nhân x ét:
- Khi không có Aslem, nồng độ IL-4 có xu hướng tăng cao ở nhóm bệnh nhân so với nhóm chứng (p J.2= 0,069).
- Khi có Aslem, nồng độ IL-4 không khác biệt giữa nhóm bệnh và nhóm chứng (p3_4 = 0,556).
- Nồng độ IL-4 khi có và không có Aslem ở nhóm bệnh và nhóm chứng khác biệt không có ý nghĩa thống kê (Pj.3 = 0,15 vói nhóm bệnh, p2_4 = 0,799 vói nhóm chứng).
Bảng 3.8. Nồng độ EL-10 (pg/ml) trong môi trường nuôi cấy tế bào
Lô 1 Lô 2
PHA3ịig/ml PHA 3[j.g/ml +Aslem 0,15ịj,g/ml Bệnh nhân (n=17) (1) 148,1 (45,9 - 530,2) (3) 145,9 (35,8 - 508,4) Nhóm chứng (n=12) (2) 47,4 (30,5-5-197,2) (4) 55,6 (28,1 - 242,1) p J_2 = 0,003 p 1.3 = 0,643 p3-4 = 0,043 p 2.4 = 0,755 Nhân x ét:
- Khi không có Aslem, nồng độ IL-10 ở nhóm bệnh tăng cao có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (pt_2 = 0,003).
- Khi có Aslem, nồng độ IL-10 ở nhóm bệnh cao hơn nhóm chứng có ý nghĩa thống kê (p3_4 = 0,003).
- Sự khác biệt về nồng độ IL-10 khi có và không có Aslem không có ý nghĩa thống "kê ở cả nhóm bệnh và nhóm chứng (Pi.3 = 0,643 vói nhóm bộnh, P2-4 = 0,755 với nhóm chứng).
Phân bố nồng độ IL-4 và EL-10 được mô tả trong hình 3.3. Gạch ngang thể hiện giá trị trung vị của mẫu.
IL-4 {pgầiii) H-10 (pg/mi) 5 5 0 .0 - 5 0 0 .0 - 4 5 0 .0 - 400 0 - 350. D 300.0 250.0 200.0 150 J5- 100.0- 5 0 .0 - 0.0 Bệttii uliâu. * í • Ị * ; J 2 148,1 I IL-4 (pg/mi) 200.0' 1 5 0 1D0D' 50.0 ‘ 0.D< Nlióiii clúnia: _ ^ rI* Asleiu<-) Asiem{+) 3 0 0 .0 -r IL-iO ípgtol) Nlióiu. cliứug 2 50 .0- 200.0" 148.0 1D0J3- ŨJỒ' V
Asiem(-) Aslem(+) AslemH AsLeiu(+)
Hình 3.3. Nồng độ IL-4 và IL-10 trong nước nổi nuôi cấy PBMC
Xu hướng biến đổi nồng độ cytokin type n dưới tác dụng của Aslem được thể
hiện trong bảng 3.9 theo số lượng và tỷ lệ (%) các mẫu biến đổi.
Bảng 3.9. Xu hướng biến đổi nồng độ cytokin type n dưới tác dụng của Aslem Xu hướng biến đổi IL-4 IL-10 n % n % Bệnh nhân n=17 Tăng 7 41,2 9 52,9
Không thay đổi 8 47,1 4 23,5
Giảm 2 11,8 4 23,5
Nhóm chứng n=12
Tăng 4 33,3 5 41,7
Không thay đổi 4 33,3 3 25
Giảm 4 33,3 4 33,3
Theo quv ước chung trong miễn dịch học, nồng độ cytokin biến đổi > 10% được coi là QÓ ý nghĩa, chênh lệch nồng độ nhỏ hơn 10% được coi là không thay đổi. Nhân x ét:
- Trong số 17 mẫu nuôi cấy PBMC của bệnh nhân ung thư ĐTT, Aslem làm giảm chế tiết EL-4 ở 7 mẫu (41,2%) và giảm IL-10 ở 9 mẫu (52,9%).
- Trong số 12 mẫu nuôi cấy PBMC của người khỏe mạnh, Aslem làm giảm chế tiết IL-4 ở 4 mẫu (33,3%) và giảm IL-10 ở 5 mẫu (41,7%).
- Có một số mẫu không đáp ứng với Aslem và một số mẫu tăng chế tiết IL-4, IL-10 khi có thêm Aslem trong môi trường nuôi cấy.
PHẦN 4. BÀN LUẬN
4.1. Về sự suy giảm đáp ứng miễn dịch ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng 4.1.1. Suy giảm đáp ứng chuyển dạng tế bào lympho với tác nhân kích thích
không đặc hiệu (polyclonal mitogen)
Đáp ứng chuyển dạng tế bào lympho với tác nhân kích thích phân bào không đặc hiệu (polyclonal mitogen) là một test invitro đơn giản, thông dụng để đánh giá đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào. Đây là giai đoạn quan trọng trong quá trình hình thành đáp ứng miễn dịch. Tế bào lympho sau khi chuyển dạng sẽ thay đổi cả về hình thái lẫn chức năng, về hình thái, các tế bào chuyển dạng là các tế bào lớn, dưới kính hiển vi điện tử có thể quan sát thấy bào tương giàu ribosom, lưới nội sinh chất và ty thể [15] (hình 3.1). về chức năng, các tế bào chuyển dạng có khả năng tiết kháng thể (lympho B), khả năng gây độc tế bào (Tc, NK) hay điều hòa các đáp ứng miễn dịch đặc hiệu (TH) [15]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, đáp ứng với kích thích của PHA (là chất kích thích chủ yếu lên tế bào T [33] ở nồng độ 3|j,g/mi) cho tỷ lệ chuyển dạng ở nhóm bệnh (n =17, trung bình 2 1,6%) thấp hơn so với nhóm chứng (n = 12, trung bình 26,7%) vói p = 0,Ọ5 (bảng 3.3), chứng tỏ nhóm bệnh nhân ung thư đại trực tràng có tình trạng suy giảm đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, cụ thể là suy giảm đáp ứng của lympho T.
Sự suy giảm đáp ứng miễn dịch này được coi là hậu quả của khối u tác động trực tiếp lên các tế bào miễn dịch hoặc gián tiếp qua các sản phẩm bài tiết của khối u. Catalona (1973) [25], Glasgow A.H (1974) [30], đã quan sát thấy tác dụng ức chế của huyết thanh bệnh nhân lên sự chuyển dạng tế bào. Miescher (1986) [37] thấy sự chuyển dạng PBMC ở người khỏe mạnh bị ức chế khi thêm huyết thanh bệnh nhân vào môi trường nuôi cấy hoặc cho PBMC người khỏe
mạnh tiếp xúc với tế bào ung thư 15 phút trước khi nuôi cấy. Luo J.S (1997) [36] cũng kết luận rằng các dòng ung thư đại tràng có khả năng tiết các yếu tố ức chế miễn dịch (ISF- Immuno Suppressive Factor) dẫn đến tình trạng suy giảm miễn dịch thường quan sát thấy ở bệnh nhân ung thư.
Cho tới nay, cơ chế ức chế của khối u lên đáp ứng chuyển dạng lympho bào vẫn chưa được làm sáng tỏ, tuy nhiên sự suy giảm miễn dịch thể hiện qua đáp