PBMC được tách khỏi máu chống đông Heparin, nuôi cấy trong môi trường RPMI .1640 có 20% FCS trong 48 giờ ở điều kiện 37°c và 5% C02. Cụ thể tiến hành như sau:
• Tách PBMC bằng phương pháp ly tâm chênh lệch tỷ trọng (Density gradient centrifugation) [45]
- Pha loãng máu chống đông với dung dịch RPM I1640 (Gibco) tỷ lệ 1:1. - Hút 3 ml máu đã pha loãng cho chảy nhẹ nhàng theo thành ống nghiêm vào ống nghiệm 5ml (Grenier Bio-one) đã chứa sẵn 1 ml dung dịch Ficoll Hypacque (tỷ trọng 1,077; PTL 400 000; Lymphoprep™), tạo thành 2 lớp rõ rệt.
- Ly tâm 2500 vòng/phút trong 20 phút ở 4°c (máy Beckman Avanti 30 - EuropContinent, Rotor S0410), sẽ xuất hiện 4 lớp rõ rệt : dưới cùng là hồng cầu và bạch cầu đa nhân, rồi đến khối Ficoll, trên bề mặt Ficoll là một lớp màng tế bào màu trắng (còn gọi là đám mây tế bào) và trên cùng là huyết tương (hình 6)
- Hút nhẹ nhàng lớp tế bào trắng sang ống nghiệm khác, rửa 2 lần bằng dung dịch RPMI (mỗi lần rửa ly tâm 1800 vòng/phút 4°c trong 10 phút).
- Đếm số lượng tế bào trên buồng đếm bạch cầu.
Hình 2.1. Sự tách lớp tế bào bằng phương pháp ly tâm chênh lệch tỷ trọng
• Nuôi cấy tế bào PBMC theo tài liệu của Shigenori Goto 1999 [31]
Mỗi mẫu được cấy thành 2 lô: lô có Aslem 0,15|ig/ml và lô chứng không có Aslem. Mỗi lô cấy 3 giếng (sử dụng plate 12 giếng nuôi cấy của Nunc). Thành phần có trong mỗi giếng được mô tả trong bảng 2.1.
w (Chất béo) SERUM/ media (Huyết thanh.) PBMC RC0LL- HỈPầOU£ RfMAjNING WHFTECEU3 m&mjLS Hổag cầu và bạcbL
Bảng 2.1. Thành phần của một giếng nuôi cấy Lô 1 PHA 3p.g/ml Lô 2 PHA 3 pg/ml + Aslem 0,15p,g/ml - lml RPMI20% FCS - 1 X 106 tế bào PBMC
- 3|il dung dịch PHA lmg/ml
- lml RPMI20% FCS
- 1 X 106 tế bào PBMC
- 3|il dung dịch PHA lmg/ml - 0.5 |Lil dung dịch Aslem 0,3mg/ml
Tế bào được nuôi cấy 48 giờ trong điều kiện 37°c 5% C02 luôn được làm ẩm sử dụng tủ cấy C02 Incubator (Sanyo).