Là nghiên cứu tiến cứu. Tác dụng kích thích miễn dịch của Aslem được nghiên cứu in vitro dựa trên khả năng chuyển dạng và chế tiết cytokin của tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC-Peripheral Blood Mononuclear Cell) ở hai nhóm : bệnh nhân ung thư đại trực tràng và nhóm chứng là những người cho máu có cùng phân bố tuổi và giới.
Thử nghiệm được chia thành 2 lô:
• Lô chứng : môi trường có PHA (3|ig/ml)
• Lồ thử: môi trường có PHA (3|^g/ml) và Aslem nồng độ (0,15 ịig/ml) Cụ thể các bước tiến hành như sau:
2.2.1. Ghi nhận thông tin và lấy mẫu
A. Nhóm bệnh nhân ung thư đại trực tràng
- Bệnh nhân nhập viện được ghi nhận thông tin tuổi, giói, khám lâm sàng, các xét nghiệm huyết học, sinh hóa, chẩn đoán hình ảnh .
- Ghi nhận mô tả tổn thương, cách thức phẫu thuật của phẫu thuật viên cũng như xét nghiệm đại thể và vi thể của khối u, hạch phẫu tích.
- Phân loại giai đoạn bệnh theo hệ thống phân loại Duke [8]
• Dukes A : ung thư ở lớp niêm mạc, dưới niêm hoặc ăn xuống lớp cơ của đại trực tràng.
• Dukes B: ung thư đã ăn xuống tới thanh mạc hoặc qua thanh mạc nhưng chưa di căn.
• Dukes C: đã có di căn (hạch vùng hoặc di căn xa).
- Lấy 6 ml máu tĩnh mạch cánh tay sau phẫu thuật vào tube chống đông bằng Heparin. PBMC được tách và nuôi cấy trong vòng 3 giờ kể từ khi lấy máu.
B. Nhóm chứng
- Ghi nhận các thông tin về tuổi, giới, xét nghiệm huyết học.
- Lấy 6 ml máu tĩnh mạch cánh tay vào tube chống đông bằng Heparin. PBMC được tách và nuôi cấy trong vòng 3 giờ kể từ khi lấy mẫu.
2.2.2. Tách và nuôi cấy PBMC
PBMC được tách khỏi máu chống đông Heparin, nuôi cấy trong môi trường RPMI .1640 có 20% FCS trong 48 giờ ở điều kiện 37°c và 5% C02. Cụ thể tiến hành như sau:
• Tách PBMC bằng phương pháp ly tâm chênh lệch tỷ trọng (Density gradient centrifugation) [45]
- Pha loãng máu chống đông với dung dịch RPM I1640 (Gibco) tỷ lệ 1:1. - Hút 3 ml máu đã pha loãng cho chảy nhẹ nhàng theo thành ống nghiêm vào ống nghiệm 5ml (Grenier Bio-one) đã chứa sẵn 1 ml dung dịch Ficoll Hypacque (tỷ trọng 1,077; PTL 400 000; Lymphoprep™), tạo thành 2 lớp rõ rệt.
- Ly tâm 2500 vòng/phút trong 20 phút ở 4°c (máy Beckman Avanti 30 - EuropContinent, Rotor S0410), sẽ xuất hiện 4 lớp rõ rệt : dưới cùng là hồng cầu và bạch cầu đa nhân, rồi đến khối Ficoll, trên bề mặt Ficoll là một lớp màng tế bào màu trắng (còn gọi là đám mây tế bào) và trên cùng là huyết tương (hình 6)
- Hút nhẹ nhàng lớp tế bào trắng sang ống nghiệm khác, rửa 2 lần bằng dung dịch RPMI (mỗi lần rửa ly tâm 1800 vòng/phút 4°c trong 10 phút).
- Đếm số lượng tế bào trên buồng đếm bạch cầu.
Hình 2.1. Sự tách lớp tế bào bằng phương pháp ly tâm chênh lệch tỷ trọng
• Nuôi cấy tế bào PBMC theo tài liệu của Shigenori Goto 1999 [31]
Mỗi mẫu được cấy thành 2 lô: lô có Aslem 0,15|ig/ml và lô chứng không có Aslem. Mỗi lô cấy 3 giếng (sử dụng plate 12 giếng nuôi cấy của Nunc). Thành phần có trong mỗi giếng được mô tả trong bảng 2.1.
w (Chất béo) SERUM/ media (Huyết thanh.) PBMC RC0LL- HỈPầOU£ RfMAjNING WHFTECEU3 m&mjLS Hổag cầu và bạcbL
Bảng 2.1. Thành phần của một giếng nuôi cấy Lô 1 PHA 3p.g/ml Lô 2 PHA 3 pg/ml + Aslem 0,15p,g/ml - lml RPMI20% FCS - 1 X 106 tế bào PBMC
- 3|il dung dịch PHA lmg/ml
- lml RPMI20% FCS
- 1 X 106 tế bào PBMC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- 3|il dung dịch PHA lmg/ml - 0.5 |Lil dung dịch Aslem 0,3mg/ml
Tế bào được nuôi cấy 48 giờ trong điều kiện 37°c 5% C02 luôn được làm ẩm sử dụng tủ cấy C02 Incubator (Sanyo).
2.2.3. Thu hoạch môi trường và tế bào sau 48 giờ nuôi cấy
- Gộp dung dịch nước nổi nuôi cấy tại 3 giếng của mỗi lô và bảo quản trong các ống Eppendoff ở -70°c đến khi sử dụng.
- Gộp tế bào tại 3 giếng nuôi cấy lên lam kính, để khô tự nhiên sau đó nhuộm Giemsa xác định tỷ lệ tế bào chuyển dạng.
2.2.4. Xác định tỷ lệ tế bào chuyển dạng.
- Cố định tế bào trên các lam bằng cồn tuyệt đối, để khô tự nhiên.
- Nhỏ thuốc nhuộm Giemsa lên mặt lam kính, để 15 phút, rửa, để khô tự nhiên. - Xác định tỷ lệ tế bào chuyển dạng trên kính hiển vi với độ phóng đại 10x100. - Tỷ lệ tế bào chuyển dạng là số tế bào chuyển dạng trên 100 tế bào được đếm.
- Các mẫu nước nổi nuôi cấy tế bào bảo quản ở -70°c được để tan tự nhiên ở nhiệt độ thường trước khi định lượng.
- Cytokin trong môi trường nuôi cấy được định lượng bằng kỹ thuật miễn dịch hấp phụ enzyme, ELISA (Enzym linked immunosorbant assay).
- Các bước định lượng được tiến hành theo quy trình định lượng của hãng. Nguyên tác kỹ thuât ELISA đinh lương cvtokin
Phản ứng ELISA định lượng cytokin được tiến hành theo kỹ thuật Sandwich ứng dụng để định lượng cytokin trong huyết thanh, dịch nuôi cấy tế bào và các dịch sinh học khác. Kháng thể đơn dòng kháng cytokin được gắn trên pha rắn (thành giếng định lượng). Kháng nguyên cytokin trong môi trường nuôi cấy gắn đặc hiệu với kháng thể trên pha rắn, sau khi rửa, cho thêm kháng thể thứ 2 gắn Biotin tạo thành phức hợp KT-KN-KT-Biotin. Enzym oxy hóa được gắn lên phức hợp thông qua liên kết Biotin-Streptavidin tạo phức hợp KT-KN-KT-Biotin- Streptavidin-HRP (Horse Radish Peroxydase) gắn trên thành ống nghiệm. Phức hợp được phát hiện nhờ phản ứng giữa cơ chất và TMB (TetraMethylBenzidine) tạo sản. phẩm màu xanh, chuyển thành màu vàng ở môi trường acid. Đo quang ở bước sóng 450nm, cường độ màu tỷ lệ với lượng cytokin cần xác định trong dịch nuôi cấy tế bào.
Kit được sử dụng để định lượng IL-4, IL-10, IFNy là các kit có độ nhạy cao (high sensitivity), sử dụng chất mang là Amdex, một chất được cấu tạo bởi một chuỗi Dextran mạch thẳng có gắn hàng trăm phân tử HRP và khoảng 10 phân tử Streptavidine. Amdex cho phép phát hiện các cytokin ở nồng độ rất thấp nhờ khả năng khuyếch đại tín hiệu.
Hình 2.2. Nguyên tắc kỹ thuật ELISA
1: pha rắn ị thành giếng định lượng) 2: kháng thể thứ nhất gắn lên pha rắn 3: kháng nguyên (cytokin)
4: kháng thể thứ hai gắn biotin 5: biotin
6: streptavidin
7: men oxy hóa 8: đo quang
Định lượng IL-4, IL-10, IFNy được tiến hành theo kỹ thuật Sandwich 2 giai đoạn với các kit có độ nhạy cao của hãng Amersham Biosciens. IL-2 được định lượng bằng kỹ thuật Sandwich 1 giai đoạn của cùng hãng Amersham Biosciens .
Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê y học vói sự trợ giúp của phần mềm SPSS 10.0
- Thống kê mô tả được biểu diễn dưới dạng trung bình ±độ lệch chuẩn đối với các biến số phân bố chuẩn, trung vị (median) đối với các biến số không tuân theo phân bố chuẩn, giá trị lớn nhất, giá trị nhỏ nhất, tỷ lệ phần trăm.
- So sánh giá tri trung bình của các mẫu sử dụng test T Student đối với các biến phân bố chuẩn, sử dụng test u Mann-Whitney với số liệu không tuân theo phân bố chuẩn.So sánh các tỷ lệ sử dụng test %2.
- Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05
Từ tháng 6 năm 2002 đến tháng 4 năm 2003 có 21 bệnh nhân và 12 người bình thường khoẻ mạnh tham gia vào nghiên cứu, trong đó có 4 bệnh nhân bị loại khỏi nhóm nghiên cứu do phải truyền máu trong quá trình phẫu thuật.
3.1. Đặc điểm của nhóm bệnh và nhóm chứng
Hai nhóm nghiên cứu đã được khảo sát về đặc điểm dịch tễ học (bảng 3.1) và các thông số miễn dịch trong máu ngoại vi (bảng 3.2).
PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Bảng 3.1. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân và nhóm chứng Bệnh nhân (n=17) Nhóm chứng (n=12) p Tuổi 50,7+2,4.(24-5-70) 48,4+3,7 (41 - 57) 0,765* Giới Nam 12 (70,6 %) 8 (66,7 %) 0,822** Nữ 5 (29,4 %) 4(33,3 %) Vị trí u Đại tràng 7 (41,2%) Trực tràng 10 (58,8%) Giai đoạn Duke A-B 7 (41,2%)
bệnh Duke c 10 (58,8%)
* So sánh sử dụng test T Student. ** So sánh sử dụng test khi bình phương Nhân x ét: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Sự phân bố theo tuổi và giói giữa nhóm bệnh và nhóm chứng là tương đối đồng đều và khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
- Trong số 17 bệnh nhân nghiên cứu có 10 bệnh nhân ung thư trực tràng (58,8%) và 7 bộnh nhân ung thư đại tràng (41,2%) bao gồm 1 ung thư đại tràng trái, 2 ung thư đại tràng phải và 4 ung thư đại tràng sigma.
- Có 1 bệnh nhân ở giai đoạn Duke A; 6 bệnh nhân ở giai đoạn Duke B và 10 ở giai đoạn Duke c.
Bảng 3.2. Các thông số miễn dịch trong máu ngoại vi Bệnh nhân (n=17) Nhóm chứng (n=12) p Bạch cầu (106 tb/cm3) 8,5 ±3,8 (4,6 4-16,7) 7,2 ±2,1 (4,4+ 9,8) 0,304* Tỷ lệ lymphocyte (%) 23,9 ± 9,8 (11 -ỉ- 50,3) 29,8 ±8,3 (17,3-46,7) 0,109* Số lượng lymphocyte (106 tb/cm3) 2,1 ±0,7 (1,3-3,9) 2,2 ±1,1 (1,1 4,4) 0,618* CEA (ng/ml) 4(1-177)** - - * So sánh sử dụng test T Student
** Nồng độ CEA trong máu không tuân theo phân bố chuẩn nên được biểu diễn theo trùng vị của mẫu. Tri số trong ngoặc là giá tri lớn nhất và nhỏ nhất của mẫu. Nhân x é t: Các kết quả ở bảng 3.2 cho thấy
- Số lượng bạch cầu ở nhóm bệnh nhân hơi cao hơn nhóm chứng (8,5 so với 7,2) tuy nhiên tỷ lệ lymphocyte lại thấp hơn so với nhóm chứng (23,9% với 29,8%). Số lượng lymphocyte ờ hai nhóm tương đương nhau và khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
- Nồng độ CEA trong máu bệnh nhân phân bố tương đối rộng (1 H-177), 11 bệnh nhân (64,7%) có nồng độ CEA < 10ng/ml, 6 bệnh nhân (35,3%) có nồng độ CEA
tăng cao >10 ng/ml.
3.2. Tỷ lệ chuyển dạng tế bào lympho sau 48 giờ nuôi cấy
Sau 48 giờ nuôi cấy, tế bào PBMC trong 3 giếng của mỗi lô được gộp chung lại, nhỏ trên lam kính, để khô rồi nhuộm Giemsa. Tế bào chuyển dạng được quan sát và xác định trên kính hiển vi với độ phóng đại 100x10 (hình 3.1), đó là các tế bào lớn hơn tế bào bình thường, có thể quan sát thấy nhiều hạt trong bào tương. Tỷ lộ tế bào chuyển dạng là số tế bào chuyển dạng trong số 100 tế bào được đếm.
Bảng 3.3. Tỷ lệ chuyển dạng tế bào của PBMC sau 48h nuôi cấy (%)
Lô 1 Lô 2
PHA 3|ig/ffil PHA 3|Ẳg/ml+Aslem 0,15|j.g/ml Bệnh nhân (n=17) (1) 21,6±7,8 (11 -ỉ- 38) (3) 33,6± 8,2 (21 - 56) Nhóm chứng (n=12) (2) 26,7±5,9 (18-Ỉ-40) (4) 36,3±7,5 (26-54) p 1_2= 0,05 p J.3 < 0,001 ỹ 3A = 0,367 p 2.4 = 0,002
* Kết quả trong bảng là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (nhỏ nhất -ỉ- lớn nhất), so sánh 2 giá trị trung bình theo test T Student.
Nhân x ét:
- Đáp ứng chuyển dạng ở nhóm bệnh có xu hướng thấp hơn so vói nhóm chứng khi không có Aslem trong môi trường nuôi cấy (Pj.2 = 0,05).
- Đáp ứng chuyển dạng ở cả nhóm bệnh và nhóm chứng khi có Aslem cao hơn có ý nghĩa so với không có Aslem (p !_3< 0,001 ở nhóm bệnh, p 2-4 = 0,002 ở nhóm
chứng).
- Đáp ứng chuyển dạng ở nhóm bệnh thấp hon không có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng trong môi trường có Aslem (p 3.4= 0,367).
3.3. Nồng độ cytokin trong nước nổi nuôi cấy
Các cytokin được lựa chọn trong nghiên cứu này là IL-2, IFNy, IL-4, IL-10, được định lượng theo kỹ thuật Sandwich một và hai giai đoạn, sử dụng kit của Amersham Biosciens.
Nồng độ các cytokin trong môi trường nuôi cấy phân bố khá rộng, không tuân theo phân bố chuẩn. Vì vậy, chúng tôi sử dụng giá trị trung vị để đại diện cho mẫu. Các phép so sánh sử dụng test u Mann Whitney.
Nồng độ cytokin type I trong các môi trường nuôi cấy được thể hiện qua bảng 3.4 và 3.5.
Bảng 3.4. Nồng độ EL-2 (pg/ml) trong môi trường nuôi cấy tế bào
Lô 1 Lô 2
PHA 3ịj.g/ml PHA 3|ig/ml +Aslem 0,15|ig/ml Bệnh nhân (n=17) (1) 98,4 (51,1-5-132) (3) 105,6 (52,0 H-129,3) Nhóm chứng (n=12) (2) 104,3 (80,2-5-125,6) (4) 114,3 (56,6-ỉ-123,8) p !_2= 0,18 p 1-3 = 0,563 p 3-4 = 0,74 p 2.4 = 0,298 Nhân x é t:
I
vói nhóm chứng (98,4 so với 104,3), p !_2 = 0,18.
- Sự khác biệt về nồng độ IL-2 khi có Aslem và không có Aslem ở cả nhóm bệnh và nhóm chứng đều không có ý nghĩa thống kê (p J.3 = 0,563 vói nhóm bệnh, p 2_4= 0,298 với nhóm chứng).
Bảng 3.5. Nồng độ IFNy (pg/ml) trong môi trường nuôi cấy tế bào (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lô 1 Lô 2
PHA 3ịig/ml PHA 3ịj.g/ml +Aslem 0,15ịu.g/ml Bệnh nhân (n=17) (1) 68,2 (43,3 - 1983,1) (3) 64,3 (45,5-2126,2) Nhóm chứng (n=12) (2) 70,8 (48,1-292,0) (4) 57,7 (52,5 4-132,8) p 1-2= 0,948 p 1-3 = 0,683 p 3.4 = 0,347 p 2-4 = 0,887 Nhân x é t:
- Khi không có Aslem, chúng tổi không thấy có sự khác biệt về nồng độ IFNy giữa nhóm bệnh và nhóm chứng, p ^2= 0,948.
- Sự khác biệt về nồng độ IFNy khi có và không có Aslem ở cả nhóm bệnh và nhóm chứng đều không có ý nghĩa thống kê (Pj.3 = 0,683 với nhóm bệnh, p2-4= 0,887 với nhóm chứng).
# 0 % A % ® 0 0
Hình 3.1. Hình ảnh chuyển dạng tế bào lympho.
• Cấc tế bào đánh số 1 được đọc là chuyển dạng.
Phân bố nồng độ IL-2 và IFNy được mô tả trong hình 3.2. Gạch ngang thể hiện giá trị trung vị của mẫu.
IL-2 (ịỊgảul) IL-2 (pg.mi)
140 °"1 NUóm clxứu.2 50.D- 0 J ữ ' « Aslem(-) ÀsleiìiB*) IFN gaaiuia (p$/ml) 2mô-r 2000.0- 1500.0' Bệtili alỉáa Asleiii(-) Asleiu.(+)
IFN gamma (pg/uxi)
ÍS0.0'
Niióm cliứua;
V"0JI
AsleuU -) AslemH)
Hình 3.2. Nồng độ IL-2 và IFNy trong nước nổi nuôi cấy PBMC
Xu hướng tác dụng của Aslem lên sự chế tiết cytokin được đánh giá thông qua sự tăng giảm nồng độ cytokin trong môi trường nuôi cấy có Aslem so với không có Aslem. Bảng 3.6 thể hiện xu hướng biến đổi nồng độ cytokin type I dưới tác dụng của Aslem theo số lượng và tỷ lệ (%) cắc mẫu biến đổi.
Bảng 3.6. Xu hướng biến đổi nồng độ cytokin type I dưói tác dụng của Aslem Xu hướng biến đổi IL-2 IFNy n % n % Bệnh nhân n=17 Tăng 7 41,2 6 35,3
Không thay đổi 5 24,9 9 52,9
Giảm 5 24,9 2 11,8
Nhóm chứng n=12
Tăng 7 58,3 4 33,3
Không thay đổi 2 16,7 2 16,7
Giảm 3 25 6 50
Theo quv ước chung trong miễn dịch học, nồng độ cytokin biến đổi > 10% được coi là có ý nghĩa, chênh lệch nồng độ nhỏ hơn 10% được coi là không thay đổi. Nhân x é t:
- Trong số 17 mẫu nuôi cấy PBMC của bệnh nhân ung thư ĐTT, Aslem làm tăng chế tiết JL-2 ở 7 mẫu (41,2%) và tăng IFNy ở6 mẫu (35,3%).
- Trong số 12 mẫu nuôi cấy PBMC của người khỏe mạnh, Aslem làm tăng chế tiết IL-2 ở 7 mẫu (58,3%) và tăng IFNy ở 4 mẫu (33,3%)-
- Có một số mẫu không đáp ứng vói Aslem và một số mẫu giảm chế tiết IL-2, IFNy khi có thêm Aslem trong môi trường nuôi cấy.
Nồng độ cytokin type n trong các môi trường nuôi cấy được thể hiện qua bảng 3.7 và 3.8 .
Bảng 3.7. Nồng độ IL-4 (pg/ml) trong môi trường nuôi cấy tế bào (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lô 1 Lô 2
PHA 3ịj.g/ml PHA 3ịig/ml +Aslem 0,15p,g/ml Bệnh nhân (n=17) (1) 40,2 (32,7-5-47,2) (3) 37,4 (28,1 - 215,7) Nhóm chứng (n=12) (2) 36 (27,1-48,1) (4) 36,5 (26,7 225,5) Pl.2= 0,069 p 1.3 = 0,150 p3_4= 0,556 p 2-4 = 0,799 Nhân x ét:
- Khi không có Aslem, nồng độ IL-4 có xu hướng tăng cao ở nhóm bệnh nhân so với nhóm chứng (p J.2= 0,069).
- Khi có Aslem, nồng độ IL-4 không khác biệt giữa nhóm bệnh và nhóm chứng (p3_4 = 0,556).
- Nồng độ IL-4 khi có và không có Aslem ở nhóm bệnh và nhóm chứng khác biệt không có ý nghĩa thống kê (Pj.3 = 0,15 vói nhóm bệnh, p2_4 = 0,799 vói nhóm chứng).
Bảng 3.8. Nồng độ EL-10 (pg/ml) trong môi trường nuôi cấy tế bào
Lô 1 Lô 2
PHA3ịig/ml PHA 3[j.g/ml +Aslem 0,15ịj,g/ml Bệnh nhân (n=17) (1) 148,1 (45,9 - 530,2) (3) 145,9 (35,8 - 508,4) Nhóm chứng (n=12) (2) 47,4 (30,5-5-197,2) (4) 55,6 (28,1 - 242,1) p J_2 = 0,003 p 1.3 = 0,643 p3-4 = 0,043 p 2.4 = 0,755 Nhân x ét:
- Khi không có Aslem, nồng độ IL-10 ở nhóm bệnh tăng cao có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (pt_2 = 0,003).
- Khi có Aslem, nồng độ IL-10 ở nhóm bệnh cao hơn nhóm chứng có ý nghĩa thống kê (p3_4 = 0,003).
- Sự khác biệt về nồng độ IL-10 khi có và không có Aslem không có ý nghĩa