2.3.4.1. Phương pháp nhuộm nhân tế bào trứng
Cố định và nhuộm trứng được thực hiện theo phương pháp của Moniruzzaman et al. (2009). Trứng sau khi nuôi thành thục invitro, chuyển trứng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30 vào các giọt môi trường 50µl có chứa 100mg/ml hyaluronidase trong PBS từ 12– 15’ để tách tế bào cumulus. Trứng sau khi đã tách tế bào được đặt và cố định lên lam kính bằng lam men. Lam kính có trứng được giữ trong môi trường cố định (25% acetic acid in ethanol) cho đến khi được nhuộm bằng hematoxylin và eosin.
Tiến hành soi nhân tế bào trứng đã nhuộm trên kính hiển vi. Chúng ta sẽ nhìn thấy trứng ở các trạng thái của nhân ở các giai đoạn như sau:
GV (germinal vesicle): giai đoạn bóng mầm, màng nhân chưa tan GVBD (germinal vesicle breakdown): màng nhân tan
MI (metaphase I): nhiễm sắc thểở kì giữa của giảm phân I
MII (metaphase II): nhiễm sắc thể ở kì giữa của giảm phân II, xuất hiện thể
cực thứ nhất, những tế bào trứng này được coi là thành thục và có thể đem đi thụ
tinh hoặc sử dụng để nhân bản.
Deg (degenerated): trứng thoái hoá, không có nhiễm sắc thể hoặc nhiễm sắc thể phân tán thành nhiều hạt nhỏ xung quanh tế bào chất.
2.3.4.2. Phương pháp nhuộm huỳnh quang tế bào trứng
Trứng sau khi được nuôi thành thục được loại bỏ tế bào cận noãn để tiến hành nhuộm bằng FDA và PI nhằm đánh giá tỷ lệ sống. Sau khi tách sạch tế bào cận noãn, chuyển trứng vào môi trường nhuộm có FDA (3’6’ fluorescein diacetate; Sigma, St Louis, MO, USA) nồng độ 5 mcg/mL và PI (Propidium iodide, Calbiochem, San Diego, CA) nồng độ 1 mcg/mL. Các tế bào trứng được đặt trong giọt chứa thuốc nhuộm trong vòng 3 phút, rửa sạch hai lần bằng dung dịch PBS sau
đó kiểm tra bằng kính hiểm vi huỳnh quang (Nikon, eclipse 80i, Nhật bản). Trứng còn sống bắt màu xanh và những trứng chết có nhân bắt màu đỏ.