2.3.2.1. Môi trường đông lạnh trứng
Dung dịch nền cho các loại dung dịch xử lý trong đông lạnh trứng là TCM- 199 có chứa 2,5 mg/mL HEPES (H-7523, Sigma), 2,47 mg/mL Na-HEPES (H- 8651, Sigma), 0,35 mg/mL NaHCO3 và 0,05 mg/mL kanamycin sulfate. Dung dịch cân bằng gồm TCM-199 bổ sung 20% huyết thanh bê (FCS., Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan), ethylene glycol (EG, Sigma) và dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma) theo từng thí nghiệm. Dung dịch vitrification bao gồm TCM-199 bổ sung 20% huyết thanh bê (FCS., Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan), nồng
độ các chất EG, DMSO và ethylene glycol (EG, Sigma) được bổ sung theo từng thí nghiệm. Dung dịch rã đông bao gồm 20% FCS. trong TCM-199 và chứa 0,5 M sucrose. Dung dịch khửđộc sau đông lạnh gồm 20% FCS. trong TCM-199 có chứa 0,25M sucrose. Sau khi xử lý qua dung dịch khử độc, trứng được chuyển vào môi
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28 trường bình thường không chứa sucrose trước khi được nhuộm để đánh giá hoặc nuôi thành thục invitro.
2.3.2.2. Phương pháp đông lạnh cực nhanh (vitrification)
Đông lạnh cực nhanh theo phương pháp của Moniruzzaman et al. (2009). Mẫu trứng non được đặt trong các đĩa nuôi vô trùng. Rửa mẫu qua ba lần bằng môi trường TCM-199 có chứa 0,255mM pyruvate, 25mM HEPES, 10ml/l kháng sinh và 20% (v/v) FBS. Chuyển vào môi trường cân bằng 30 phút trên đá lạnh, sau đó chuyển vào môi trường vitrification trong 5 phút. Mảnh buồng trứng sau đó được nạp vào cọng rạ và nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng -1960C, sau đó cho vào bình nitơ
lỏng bảo quản lâu dài.
2.3.2.3. Phương pháp đông lạnh trứng bằng cryotop
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp theo Inaba et al.
(2011), có thay đổi cho phù hợp với trứng lợn non. Mẫu trứng non sau khi xử lý trong môi trường cân bằng, chuyển qua môi trường đông lạnh, đặt lên cryotop và nhúng thẳng vào nitơ lỏng. Quá trình đặt trứng lên cryotop và nhúng vào nitơ lỏng chỉ trong vòng 1 phút, do vậy chỉđược đặt 1-2 trứng lên 1 cryotop.
Hình 2.4. Cấu trúc dụng cụ cryotop. Thanh polypropylene (a) gắn với giá đỡ
bằng nhựa (b). sau khi đặt mẫu đông lạnh lên trên thì đậy bằng ống nhựa (c) có nút bảo vệ mẫu trong nitơ (d)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29