2.11.1 Sơ lƣợc về IgY
IgY là một globulin miễn dịch được mô tả lần đầu tiên vào năm 1893 khi Klemperer chủng ngừa gà để sản xuất kháng thể và phát hiện nồng độ kháng thể trong lòng đỏ trứng gà cũng tương đương trong máu. Khi Klemperer phát hiện globulin miễn dịch gà vào cuối năm 1800, ông đã đặt tên chúng là IgG. Sau đó, người ta đã đổi tên globulin miễn dịch này thành IgY không phải vì chúng được tìm thấy trong lòng đỏ mà vì chúng khác các globulin miễn dịch của động vật có vú (IgG). Hiện nay, IgY là lớp globulin miễn dịch chủ yếu ở các loài chim, bò sát, loài lưỡng thê và loài cá phổi.
Ở loài chim đã tìm thấy 3 loại kháng thể: IgA, IgM và IgY. IgA và IgM thì tương tự như IgA và IgM của loài hữu nhũ, riêng IgY là globulin miễn dịch chính có trong huyết thanh và lòng đỏ trứng. IgY hình thành khoảng 75% tổng số globulin miễn dịch.
Theo Rose và Hatta (1974), IgY là các lớp kháng thể được tìm thấy trong lớp chim có cấu trúc tương tự như IgG ở động vật có vú với 2 chuỗi nặng (65- 70 kDa) và 2 chuỗi nhẹ (22-30 kDa) liên kết với nhau bằng các cầu nối disulfit (-S-S-). Trọng lượng của phân tử IgY xác định theo phương pháp SDS-PAGE trong khoảng 180 kDa. Khác với chuỗi nặng của IgG, chuỗi nặng của IgY không có vùng bản lề. Đây có thể là lý do làm cho IgY có nhiều đặc tính sinh học khác với IgG ở động vật có vú. Vùng Fc của IgY gián tiếp quy định chức năng của nó như sự ngưng kết bổ thể, hay opsonin hóa kháng nguyên.
Khi bị nhiễm vi sinh vật hoặc được gây miễn dịch, gà cũng tạo ra các kháng thể đặc hiệu chống các kháng nguyên bị nhiễm hoặc được gây miễn dịch. Đặc biệt là các kháng thể IgY đặc hiệu không chỉ có trong máu gà mái mà còn được chuyển sang lòng đỏ để thực hiện chức năng sinh lý bảo vệ phôi và gà con. Các kháng thể IgY đặc hiệu trong trứng gà có đặc tính bảo vệ giống như các kháng thể có trong máu gà mẹ.
Kháng thể từ gà mẹ được truyền cho gà con vào giai đoạn cuối hình thành trứng, có vai trò rất quan trọng về chức năng miễn dịch liên quan đến sự suy giảm miễn dịch ở gà con và ảnh hưởng tới sức đề kháng các bệnh truyền nhiễm khác nhau. Kháng thể IgA và IgM mẹ được hợp thành trong lòng trắng trứng dọc màng ối (Rose et a., 1974). IgY trong lòng đỏ tuần hoàn trong máu gà con qua nội phôi bì của túi noãn hoàng (Patterson et al., 1962). Hàm lượng kháng thể trong lòng trắng trứng thấp (IgA ~ 0,7 mg/ml, IgM ~ 0,15 mg/ml) trong khi ở lòng đỏ IgY có hàm lượng rất cao (8 – 25mg/ml).
Khả năng thu được lượng kháng thể IgY qua trứng gà cao gấp 18 lần so với thu kháng thể từ thỏ và không làm ảnh hưởng con vật (qua lấy máu). Mức tập trung kháng thể trong lòng đỏ trứng cao: 100mg/trứng x 20 trứng/ tháng tương đương 2g kháng thể/tháng/gà.
2.11.2 Ƣu điểm của IgY
Ưu điểm vượt trội của phương pháp tạo kháng thể trên gà đó là kháng thể được thu hoạch từ trứng gà đẻ mỗi ngày chứ không phải từ máu gà.
Theo Woolley và Landon (1995), lượng kháng thể IgY tạo ra khoảng 100-400mg cho mỗi trứng gà. Mỗi năm một gà mái có thể đẻ từ 250-300 trứng, tổng sản lượng kháng thể thu được từ một con gà mái tương đương với lượng kháng thể thu được từ một con cừu hoặc một nửa con ngựa. Vì thế gây miễn dịch cho gà mái và thu kháng thể đặc hiệu từ trứng gà được coi là phương pháp hiệu quả và giá rẻ để tạo ra các kháng thể đặc hiệu.
2.11.3 Đặc tính của IgY
2.11.3.1 Đặc tính phân tử của IgY
Tương tự như IgG của loài hữu nhũ, nhưng phần Fc của IgY là vị trí có chức năng hiệu quả sinh học nhất với chuỗi 2 carbonhydrate trong khi IgG chỉ có một.
Hình 2.5 Cấu trúc của kháng thể IgG và IgY
(Nguồn: http://altweb.jhsph.edu/pubs/ecvam/ecvam21.html)
2.11.3.2 Đặc tính sinh hóa
Điểm đẳng điện của IgY thấp hơn IgG (Polson et al., 1980) trong dãy 5,7-7,6 còn IgG nằm giữa 6,1-8,5. Trong khi đó chuỗi Fc (phần kỵ nước nhất của phân tử kháng thể) của IgY thì lớn hơn của IgG, phân tử IgY kỵ nước hơn IgG.
2.11.3.3 Tính bền của IgY
Bền với pH: hoạt tính IgY giảm ở pH = 3,5 hoặc thấp hơn và hầu như hoàn toàn mất ở pH = 3 (Shimizu et al., 1988). Ở điều kiện kiềm tính, hoạt tính của IgY không thay đổi ngay cả khi pH tăng đến 11. Dù vậy, nó vẫn bị giảm ở pH = 12 hay cao hơn (Shimizu et al., 1988).
Bền với sự phân giải protein: IgY có tính đề kháng với trypsin hay chymotrysin tiêu hóa nhưng hơi nhạy cảm với pepsin tiêu hóa. Theo Hatta (1993), hầu hết hoạt tính IgY bị mất theo đường tiêu hóa với pepsin, nhưng hoạt tính được duy trì mức 39% và 41% khi ủ với trypsin và chymotrypsin sau 8h.
Bền với nhiệt và áp suất: IgY được dùng ấm ở các mức nhiệt khác nhau cho các giai đoạn khác nhau về thời gian. Hoạt tính gắn kết của IgY với kháng
Hatta (1993) IgY bền với nhiệt độ 600
C – 700C. Hoạt tính IgY giảm do sự làm nóng trong 15 phút ở 700
C hay cao hơn; IgY biến tính nhiều khi làm nóng ở nhiệt độ trên 750
C (Chang et al., 1999). IgY có tính bền với áp suất, IgY không bị bất hoạt bởi áp suất 4000kg/cm2
(Shimizu et al., 1988).
Bền với lạnh và khí khô: lạnh và đông khô là quá trình nhiệt thấp thường được xem như ít bị hủy hoại. Tuy nhiên, protein có lẽ phải chịu sự mất hoạt tính là kết quả của sự thay đổi cấu tạo, sự kết tập hay sự bám hút (Skrabania et al., 1994). Một số báo cáo về tính bền của IgY liên quan đến các phương pháp này: lạnh khô không làm ảnh hưởng tới hoạt tính của IgY trừ khi lặp lại nhiều lần (Shimizu et al., 1988). Dù vậy, Chansarker (1998) chỉ ra rằng sự đông hay lạnh khô IgY gây hậu quả ở một số mất mát về hoạt tính gắn kết kháng nguyên và giảm một cách đáng kể tính tan dưới điều kiện hàm lượng muối và protein cao.
2.11.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu IgY
Theo Sarker và Hatta (2001), hiện nay trên thế giới bên cạnh các nghiên cứu tạo kháng thể gà chống các tác nhân nhiễm trùng và ứng dụng thành công trong điều trị bệnh thú y ở các loài như lợn, bò, chó, gà đã có một số nơi nghiên cứu chế tạo kháng thể gà kháng các tác nhân tiêu chảy ở người trong đó có kháng rotavirus và E.coli (Kovacs-Nolan et al., 2004). Một số các nghiên cứu về sử dụng IgY trong việc phòng và trị bệnh trong chăn nuôi thủy hải sản cũng đã được tiến hành. Sử dụng kháng thể IgY chống vi khuẩn
Yershinia ruckeri trong phòng và điều trị bệnh nhiễm khuẩn máu trên cá hồi cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh và chết của cá giảm khi cho ăn thức ăn có chứa kháng thể.
Chƣơng 3: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 Nội dung thí nghiệm.
- Xác định liều gây chết 50% vịt thí nghiệm (LD50).
- Xác định liều kháng thể bảo hộ 50% phôi vịt thí nghiệm (PD50). - Khảo sát hiệu quả phòng và trị bệnh của kháng thể IgY trên vịt con. - Khảo sát khả năng trị bệnh của kháng thể IgY trên vịt con.
3.2 Phƣơng tiện thí nghiệm 3.2.1 Thời gian và địa điểm 3.2.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 6 đến tháng 12 năm 2014. Địa điểm thí nghiệm:
Thí nghiệm trên phôi vịt: xét nghiệm phản ứng trung hòa virus được thực hiện tại phòng thí nghiêm virus học, bộ môn Thú Y, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ.
Thí nghiệm trên vịt con: được thực hiện tại trại nghiên cứu và thực nghiệm Nông nghiệp, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại Học Cần Thơ.
3.2.2 Đối tƣợng thí nghiệm
- Chủng virus viêm gan vịt type I (đã được phân lập từ đàn vịt nghi mắc bệnh viêm gan vịt do virus tại tỉnh Vĩnh Long và được giám định tại viện Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ là thuộc type I, subtype 3 (DHAV-3)).
- Kháng thể IgY được tạo từ lòng đỏ trứng gà (27 mg/ml) (Phòng thí nghiệm virus học, Bộ môn thú y, Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ).
Phôi vịt 12 ngày tuổi và vịt con 3 ngày tuổi (Nguồn: trứng được mua từ hộ chăn nuôi vịt tại Kiên Giang và đã xác định là không có kháng thể kháng virus viêm gan vịt type I bằng phản ứng trung hòa virus và được ấp nở tại phòng thí nghiệm virus học, bộ môn Thú y, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ).
3.2.3 Dụng cụ, hóa chất và sinh phẩm
- Ống tiêm y tế 1 ml, găng tay, khẩu trang, giá đựng ống nghiệm, bông gòn, bình trữ lạnh, micropipette, ống falcon, kéo, dao mổ, đèn cồn, paraffin,
máy ấp trứng, đèn soi trứng, máy chụp ảnh, máng ăn, máng uống, chuồng nuôi, đèn sưởi.
- Dung dịch PBS, nước cất, cồn.
3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm
3.3.1 Chuẩn độ và xác định liều gây chết 50% vịt con thí nghiệm của DHV type I type I
Mục tiêu: xác định được liều gây chết 50% vịt thí nghiệm và khảo sát triệu chứng, bệnh tích trên vịt thí nghiệm.
Chuẩn bị vịt thí nghiệm: trứng vịt được sát trùng bằng cồn 700 và đem ấp ở nhiệt độ 370C . Sau khi ấp được 7 ngày thì tiến hành soi trứng để loại bỏ những trứng không phôi hoặc chết phôi. Trứng vịt được ấp tiếp đến 12 ngày tuổi, soi lại lần 2 chọn trứng có phôi còn sống ấp tiếp đến 25 ngày tuổi. Sau đó, chuyển qua pha nở bằng cách hạ nhiệt độ xuống còn 360
C đồng thời phun sương hằng ngày để tạo ẩm độ cho vịt nở. Ấp tiếp đến khi vịt nở. Chọn 45 vịt 3 ngày tuổi khỏe mạnh, có trọng lượng và kích thước tương đối đồng đều để làm thí nghiệm.
Bố trí thí nghiệm: dịch virus viêm gan vịt type I được pha loãng với dung dịch đệm PBS thành 9 nồng độ theo log 10 từ 100 đến 10-8, mỗi nồng độ tiêm cho 5 con vịt 3 ngày tuổi, mỗi con tiêm 0,5 ml dung dịch virus viêm gan vịt type I. Vị trí tiêm là cơ ức.
Bố trí thí nghiệm xác định liều gây chết 50% vịt thí nghiệm được trình bày qua bảng 3.1
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm tính chỉ số LD50 của DHV type 1 trên vịt thí nghiệm Độ pha loãng virus Số vịt đƣợc tiêm (con) Liều tiêm (ml/con) Vị trí tiêm 100 5 0,5 Cơ ức 10-1 5 0,5 Cơ ức 10-2 5 0,5 Cơ ức 10-3 5 0,5 Cơ ức 10-4 5 0,5 Cơ ức 10-5 5 0,5 Cơ ức 10-6 5 0,5 Cơ ức 10-7 5 0,5 Cơ ức 10-8 5 0,5 Cơ ức
Ghi nhận số vịt chết của từng nghiệm thức.
Tính liều LD50 dựa vào phương pháp Biometry của Reed & Muench (1938) như sau: Dp = % 50 % 50 % 50 50 L L L Lg LD50 = Lg LD<50 + dp x lg f Chú thích:
Dp (distance of proportion): khoảng cách tỷ lệ L <50%: phần trăm tử số chết cận dưới 50% L >50%: phần trăm tử số chết cận trên 50% Lg f: Lg10 = 1
Chỉ tiêu theo dõi:
Tỷ lệ vịt chết (%) = x 100
Số vịt chết trong nghiệm thức
Sau khi xác định được liều LD50 trên vịt, chúng tôi sử dụng liều 103,0 LD50 để gây nhiễm cho vịt trong thí nghiệm xác định hiệu quả phòng và trị bệnh viêm gan vịt do virus của kháng thể IgY trên vịt con 3 ngày tuổi.
3.3.2 Thí nghiệm xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt (PD50: protection dose 50%) của kháng thể IgY bằng phản ứng trung hòa trên phôi vịt 12 ngày tuổi
Mục tiêu: xác định được liều bảo hộ 50% phôi vịt của dịch kháng thể để tiếp tục tiến hành thí nghiệm phòng và trị bệnh viêm gan vịt type I.
Chuẩn bị: chuẩn bị phôi vịt 12 ngày tuổi giống như thí nghiệm xác định LD50. Pha loãng mẫu kháng thể IgY theo log 2 với 8 nồng độ từ 1/2 đến 1/1024. Chuẩn bị virus viêm gan vịt type I với liều 100 LD50.
Tiến hành: trộn virus viêm gan vịt type I và mẫu kháng thể đã chuẩn bị ở trên theo tỷ lệ 1:1 ở mỗi nồng độ. Ủ hổn hợp virus và kháng thể này ở tủ ấm 370C trong 1 giờ. Tiêm hổn hợp virus và kháng thể trên vào xoang niệu mô phôi trứng với liều 0,2ml/phôi, mỗi một nồng độ tiêm 5 phôi. Sau đó, các trứng này lại được ấp tiếp ở 370
C trong 7 ngày. Soi trứng hằng ngày và loại bỏ những phôi chết trước 24h.
Đánh giá kết quả: Nếu nồng độ kháng thể IgY đủ để trung hòa lượng virus trên thì phôi sẽ sống ngược lại thì phôi sẽ chết (sau 2-3 ngày). Phôi chết có bệnh tích còi cọc, xuất huyết và phù nề.
Tính toán liều bảo hộ 50% phôi thí nghiệm (PD50 – Protection dose 50%) theo công thức của Reed & Muench (1938).
Bố trí thí nghiệm xác định liều bảo hộ 50% vịt thí nghiệm (PD50) được trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt (PD50) của kháng thể IgY Độ pha loãng KT Liều gây nhiễm (LD50) Thể tích tiêm (kháng thể + virus) (ml) Số trứng tiêm Vị trí tiêm
1 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
1/2 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
1/4 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
1/8 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
1/16 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
1/32 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
1/64 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
1/128 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
1/256 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
1/512 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
1/1024 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
PBS 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
PBS: Phosphate buffered saline; LD50: Lethal dose (liều gây chết 50% vịt thí nghiệm); KT: Kháng thể
Sau khi tiêm định kỳ 6 giờ soi trứng một lần để kiểm tra phôi. Ghi nhận thời gian chết phôi. Loại bỏ những phôi chết trước 24h.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Tỷ lệ phôi chết = x 100
Cách tính liều bảo hộ 50% phôi thí nghiệm (PD50) theo công thức của Reed & Muench như sau:
PD = 50B
Số phôi trong nghiệm thức Tổng số phôi trong nghiệm thức
Chú thích
A là tỷ lệ phần trăm (%) nhiễm cận trên 50% B là tỷ lệ phần trăm (%) nhiễm cận dưới 50% a là nồng độ pha loãng tại A
b là nồng độ pha loãng tại B
Sau khi xác định được liều PD50 trên phôi vịt, chúng tôi sử dụng liều 10 PD50, 30 PD50, 50 PD50 để tiến hành thí nghiệm phòng và trị bệnh viêm gan vịt do virus cho vịt con 3 ngày tuổi.
3.3.3 Thử nghiệm hiệu quả phòng bệnh viêm gan vịt do virus type I bằng kháng thể IgY kháng thể IgY
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố gồm 9 nghiệm thức và 2 lần lặp lại. Mỗi nghiệm thức gồm 10 vịt 3 ngày tuổi được nuôi và chăm sóc trong điều kiện hoàn toàn giống nhau. Tổng số vịt thí nghiệm 90 con. Vịt con chọn làm thí nghiệm là những vịt khỏe mạnh, thể trạng đồng đều và không có kháng thể thụ động kháng virus viêm gan vịt type I. Tiêm mỗi vịt thí nghiệm 0,5ml dịch kháng thể. Liều kháng thể được tính theo liều bảo hộ 50% phôi vịt thí nghiệm với liều lần lượt là 10 PD50, 30 PD50, 50 PD50 và 2 lô đối chứng với K.T.V (Hanvet) (liều tiêm 0,5 ml/con) và đối chứng PBS (liều tiêm 0,5 ml/con). Đường cấp kháng thể là: cho uống và tiêm cơ ức. Sau khi tiêm kháng thể được 24h thì bắt đầu công cường độc với liều là 103,0
LD50 virus viêm gan vịt type I, vị trí tiêm là cơ ức. Vịt con thí nghiệm được theo dõi 7 ngày để ghi nhận số vịt chết ở từng nghiệm thức.
Bố trí thí nghiệm khảo sát hiệu quả phòng bệnh viêm gan vịt type I bằng chế phẩm kháng thể lòng đỏ trứng (IgY) và kháng thể K.T.V (Hanvet) được trình bày trong bảng 3.4
Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm thử nghiệm hiệu quả phòng bệnh viêm gan vịt type I