Mục tiêu: xác định được liều gây chết 50% vịt thí nghiệm và khảo sát triệu chứng, bệnh tích trên vịt thí nghiệm.
Chuẩn bị vịt thí nghiệm: trứng vịt được sát trùng bằng cồn 700 và đem ấp ở nhiệt độ 370C . Sau khi ấp được 7 ngày thì tiến hành soi trứng để loại bỏ những trứng không phôi hoặc chết phôi. Trứng vịt được ấp tiếp đến 12 ngày tuổi, soi lại lần 2 chọn trứng có phôi còn sống ấp tiếp đến 25 ngày tuổi. Sau đó, chuyển qua pha nở bằng cách hạ nhiệt độ xuống còn 360
C đồng thời phun sương hằng ngày để tạo ẩm độ cho vịt nở. Ấp tiếp đến khi vịt nở. Chọn 45 vịt 3 ngày tuổi khỏe mạnh, có trọng lượng và kích thước tương đối đồng đều để làm thí nghiệm.
Bố trí thí nghiệm: dịch virus viêm gan vịt type I được pha loãng với dung dịch đệm PBS thành 9 nồng độ theo log 10 từ 100 đến 10-8, mỗi nồng độ tiêm cho 5 con vịt 3 ngày tuổi, mỗi con tiêm 0,5 ml dung dịch virus viêm gan vịt type I. Vị trí tiêm là cơ ức.
Bố trí thí nghiệm xác định liều gây chết 50% vịt thí nghiệm được trình bày qua bảng 3.1
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm tính chỉ số LD50 của DHV type 1 trên vịt thí nghiệm Độ pha loãng virus Số vịt đƣợc tiêm (con) Liều tiêm (ml/con) Vị trí tiêm 100 5 0,5 Cơ ức 10-1 5 0,5 Cơ ức 10-2 5 0,5 Cơ ức 10-3 5 0,5 Cơ ức 10-4 5 0,5 Cơ ức 10-5 5 0,5 Cơ ức 10-6 5 0,5 Cơ ức 10-7 5 0,5 Cơ ức 10-8 5 0,5 Cơ ức
Ghi nhận số vịt chết của từng nghiệm thức.
Tính liều LD50 dựa vào phương pháp Biometry của Reed & Muench (1938) như sau: Dp = % 50 % 50 % 50 50 L L L Lg LD50 = Lg LD<50 + dp x lg f Chú thích:
Dp (distance of proportion): khoảng cách tỷ lệ L <50%: phần trăm tử số chết cận dưới 50% L >50%: phần trăm tử số chết cận trên 50% Lg f: Lg10 = 1
Chỉ tiêu theo dõi:
Tỷ lệ vịt chết (%) = x 100
Số vịt chết trong nghiệm thức
Sau khi xác định được liều LD50 trên vịt, chúng tôi sử dụng liều 103,0 LD50 để gây nhiễm cho vịt trong thí nghiệm xác định hiệu quả phòng và trị bệnh viêm gan vịt do virus của kháng thể IgY trên vịt con 3 ngày tuổi.
3.3.2 Thí nghiệm xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt (PD50: protection dose 50%) của kháng thể IgY bằng phản ứng trung hòa trên phôi vịt 12 ngày tuổi
Mục tiêu: xác định được liều bảo hộ 50% phôi vịt của dịch kháng thể để tiếp tục tiến hành thí nghiệm phòng và trị bệnh viêm gan vịt type I.
Chuẩn bị: chuẩn bị phôi vịt 12 ngày tuổi giống như thí nghiệm xác định LD50. Pha loãng mẫu kháng thể IgY theo log 2 với 8 nồng độ từ 1/2 đến 1/1024. Chuẩn bị virus viêm gan vịt type I với liều 100 LD50.
Tiến hành: trộn virus viêm gan vịt type I và mẫu kháng thể đã chuẩn bị ở trên theo tỷ lệ 1:1 ở mỗi nồng độ. Ủ hổn hợp virus và kháng thể này ở tủ ấm 370C trong 1 giờ. Tiêm hổn hợp virus và kháng thể trên vào xoang niệu mô phôi trứng với liều 0,2ml/phôi, mỗi một nồng độ tiêm 5 phôi. Sau đó, các trứng này lại được ấp tiếp ở 370
C trong 7 ngày. Soi trứng hằng ngày và loại bỏ những phôi chết trước 24h.
Đánh giá kết quả: Nếu nồng độ kháng thể IgY đủ để trung hòa lượng virus trên thì phôi sẽ sống ngược lại thì phôi sẽ chết (sau 2-3 ngày). Phôi chết có bệnh tích còi cọc, xuất huyết và phù nề.
Tính toán liều bảo hộ 50% phôi thí nghiệm (PD50 – Protection dose 50%) theo công thức của Reed & Muench (1938).
Bố trí thí nghiệm xác định liều bảo hộ 50% vịt thí nghiệm (PD50) được trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt (PD50) của kháng thể IgY Độ pha loãng KT Liều gây nhiễm (LD50) Thể tích tiêm (kháng thể + virus) (ml) Số trứng tiêm Vị trí tiêm
1 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
1/2 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
1/4 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
1/8 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
1/16 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
1/32 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
1/64 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
1/128 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
1/256 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1/512 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
1/1024 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
PBS 102 0,1+0,1 5 Xoang niệu mô
PBS: Phosphate buffered saline; LD50: Lethal dose (liều gây chết 50% vịt thí nghiệm); KT: Kháng thể
Sau khi tiêm định kỳ 6 giờ soi trứng một lần để kiểm tra phôi. Ghi nhận thời gian chết phôi. Loại bỏ những phôi chết trước 24h.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Tỷ lệ phôi chết = x 100
Cách tính liều bảo hộ 50% phôi thí nghiệm (PD50) theo công thức của Reed & Muench như sau:
PD = 50B
Số phôi trong nghiệm thức Tổng số phôi trong nghiệm thức
Chú thích
A là tỷ lệ phần trăm (%) nhiễm cận trên 50% B là tỷ lệ phần trăm (%) nhiễm cận dưới 50% a là nồng độ pha loãng tại A
b là nồng độ pha loãng tại B
Sau khi xác định được liều PD50 trên phôi vịt, chúng tôi sử dụng liều 10 PD50, 30 PD50, 50 PD50 để tiến hành thí nghiệm phòng và trị bệnh viêm gan vịt do virus cho vịt con 3 ngày tuổi.