4. đối tượng và phạm vi nghiên cứu của ựề tài
2.3.2. Phương pháp ựánh giá ựộc tắnh các nguồn NPV ựã thu thập ựược trên
trên sâu xanh, sâu khoang, sâu keo da láng
Dùng các nguồn virus ựã thu ựược từ cùng loài sâu hại ựể thắ nghiệm xác ựịnh ựộc tắnh của các nguồn.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 26
Các cá thể sâu nhiễm NPV thu thập ựược ở các ựịa ựiểm khác nhau, trên các loại cây trồng khác nhau ựược phân lập, tinh chiết và lây nhiễm lại trên chắnh vật chủ ựó trong ựiều kiện phòng thắ nghiệm ựể xác ựịnh ựộc lực của từng nguồn gen thu ựược. Các thắ nghiệm ựược tiến hành với 3 công thức tương ứng với 3 nồng ựộ dịch virus khác nhau, phun ựều dịch virus lên thức ăn nuôi sâu, ựể khô và cho sâu ăn. Các công thức thắ nghiệm gồm:
CT1: 106PIB/ml CT2: 3x 106PIB/ml CT3: 6x 106PIB/ml
đối chứng: Phun nước lã.
Mỗi công thức thắ nghiệm nhắc lại 3 lần, mỗi lần 50 cá thể sâu. Sâu thắ nghiệm là sâu tuổi 3. Theo dõi số lượng sâu sống và chết sau 3,5,7,10 ngày xử lý dịch virus.
Chỉ tiêu theo dõi:
Thời gian sâu bị chết bệnh (ngày) Tỷ lệ sâu chết virus (%)
Tỷ lệ sâu vào nhộng (%) Tỷ lệ nhộng vũ hóa (%)
độc tắnh của virus trong ựiều kiện phòng thắ nghiệm ựược ựánh giá thông qua hiệu lực tắnh theo công thức Abbott:
100 % x Ca Ta Ca H − = Trong ựó: H là hiệu lực của NPV (%)
Ca: Số sâu sống ở công thức ựối chứng Ta: Số sâu sống ở công thức thắ nghiệm
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 27
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu khả năng sử dụng NPV ựể phòng trừ sâu xanh ựục quả cà chua, sâu khoang, sâu keo da láng vùng Hà Nội
2.3.3.1. Phương pháp tạo nguồn chế phẩm NPV ựối với sâu hại trên một số cây rau chắnh
Thu nguồn sâu ngoài tự nhiên về nuôi và chọn giống
Nhân nuôi sâu xanh, sâu khoang, sâu keo da láng trên môi trường thức ăn tự nhiên là ngô bao tử, lá thầu dầu và hành hoa. Từ tuổi 1- tuổi 3 ựược nuôi tập thể, từ tuổi 4 ựược nuôi cá thể tại phòng nuôi sâu cách ly với phòng thắ nghiệm ựánh giá ựộc tắnh virus.
Dụng cụ nuôi sâu là các hộp nhựa hình trụ, ựường kắnh 10cm. Miệng hộp ựược ựậy vải màn. Hàng ngày thay thức ăn mới cho sâu. Theo dõi sự sinh trưởng phát triển của sâu vật chủ.
Khi sâu vào nhộng, tiến hành thu và xử lý nhộng bằng dung dịch thuốc tắm 5% trong 5 phút, sau ựó rửa sạch bằng nước cất. để riêng nhộng ựực, cái vào các bình bocan ựậy vải màn. để các bình bocan này ở ựiều kiện phòng thắ nghiệm cho nhộng vũ hóa.
Sau khi trưởng thành vũ hóa, tiến hành ghép cặp. Cho trưởng thành ăn thêm mật ong 5% ựể tăng lượng trứng ựẻ và kéo dài thời gian sống của trưởng thành.
Hình 1. Nhân nuôi sâu vật chủ trong phòng thắ nghiệm (Viện Bảo vệ thực vật, 2012)
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 28
Dùng sâu tuổi 4 ựể nhiễm virus. Phun dịch virus với nồng ựộ 106PIB/ml lên thức ăn nuôi sâu. Sau 4-5 ngày lây nhiễm, thu sâu chết vào các bình thủy tinh có nắp kắn, ựể thối rữa và tiến hành tinh chiết virus theo phương pháp của Smith (ựã nêu trên). Kiểm tra chất lượng dịch virus.
Kiểm tra chất lượng dịch virus bằng cách pha loãng dịch virus sau ựó sử dụng buồng ựếm hồng cầu ựể ựếm thể vùi virus và tắnh theo công thức:
a x 400 x b
X = X 10000
δ Trong ựó: X: Lượng PIB/ml a: tổng số PIB ựếm ựược b: ựộ pha loãng
δ: Số ô to ựã ựếm ựược x 16
2.3.3.2. đánh giá hiệu lực của NPV thu thập ựược trên sâu non bộ cánh vảy trong phòng trừ sâu xanh ựục quả cà chua, sâu khoang, sâu keo da láng ngoài ựồng ruộng
Việc ựánh giá hiệu lực của NPV ựược tiến hành với 3 thắ nghiệm riêng biệt tương ứng với 3 ựối tượng sâu hại cần phòng trừ.
Thắ nghiệm ựánh giá hiệu lực của NPV trên sâu xanh ựục quả cà chua:
Thắ nghiệm gồm 3 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại CT I: Phun HaNPV3 liều lượng 6x 106 PIB/ml
CTII: Phun thuốc hóa học Regent 800WG (hoạt chất Fippronil), nồng ựộ sử dụng 0,2%
CTIII: đối chứng phun nước lã Tiến hành:
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 29
- Pha dịch NPV ở nồng ựộ thắ nghiệm bằng cách sử dụng buồng ựếm hồng cầu (như ựã nêu trên). Phun ướt ựều dịch virus trên toàn bộ cây cà chua trong ô thức thắ nghiệm.
- Thuốc Regent 800WG pha 2gói (mỗi gói 1gr)/bình 16lắt, phun ướt ựều trên toàn bộ cây cà chua trong ô thắ nghiệm.
Thời gian phun vào chiều mát sau 16h bằng bình bơm tay hoặc bình bơm ựộng cơ.
Chỉ tiêu theo dõi: Mật ựộ sâu sống sau 3, 5, 7, 10 ngày phun
Thắ nghiệm ựánh giá hiệu lực của NPV trên sâu khoang hại cải bắp
Thắ nghiệm gồm 3 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại CT I: Phun SlNPV2 liều lượng 6x 106 PIB/ml
CTII: Phun thuốc hóa học Prevathon 5SC (hoạt chất Chlorantranniliprole), nồng ựộ sử dụng 0,0625%
CTIII: đối chứng phun nước lã Tiến hành:
- điều tra mật ựộ sâu trước phun.
- Pha dịch SlNPV2 ở nồng ựộ thắ nghiệm bằng cách sử dụng buồng ựếm hồng cầu (như ựã nêu trên). Phun ướt ựều dịch virus trên toàn bộ cây cải bắp trong ô thức thắ nghiệm.
- Thuốc Prevathon 5SC pha 1gói 10ml/bình 16lắt, phun ướt ựều trên toàn bộ cây cải bắp trong ô thắ nghiệm.
Thời gian phun vào chiều mát sau 16h bằng bình bơm tay hoặc bình bơm ựộng cơ.
Chỉ tiêu theo dõi: Mật ựộ sâu sống sau 3, 5, 7, 10 ngày phun
Thắ nghiệm ựánh giá hiệu lực của NPV trên sâu keo da láng hại hành
Thắ nghiệm gồm 3 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại CT I: Phun SeNPV1 liều lượng 6x 106 PIB/ml
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 30
CTII: Phun thuốc hóa học Angun 5WDG (hoạt chất Emamectinbezoat), nồng ựộ sử dụng 0,0625%
CTIII: đối chứng phun nước lã Tiến hành:
- điều tra mật ựộ sâu trước phun.
- Pha dịch SeNPV1 ở nồng ựộ thắ nghiệm bằng cách sử dụng buồng ựếm hồng cầu (như ựã nêu trên). Phun ướt ựều dịch virus trên toàn bộ hành trong ô thức thắ nghiệm.
- Thuốc Angun 5WDG pha 2gói/bình 16lắt (mỗi gói 5gr)/bình 16lắt, phun ướt ựều trên toàn bộ hành trong ô thắ nghiệm.
Thời gian phun vào chiều mát sau 16h bằng bình bơm tay hoặc bình bơm ựộng cơ.
Chỉ tiêu theo dõi: Mật ựộ sâu sống sau 3, 5, 7, 10 ngày phun
Phương pháp tắnh hiệu lực của các nguồn virus và các loại thuốc hóa học trong thắ nghiệm
Hiệu lực ựược tắnh theo công thức Henderson Ờ Tilton:
100 ) 1 ( % x Tb Ca Ta Cb H ừ ừ − = Trong ựó: H: Hiệu lực NPV (%)
Ca: Lượng sâu sống ở công thức ựối chứng sau xử lý Cb: Lượng sâu sống ở công thức ựối chứng trước xử lý Ta: Lượng sâu sống ở công thức thắ nghiệm sau xử lý Tb: Lượng sâu sống ở công thức thắ nghiệm trước xử lý
Số liệu thắ nghiệm ựược xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel và phần mềm SAS 9.2.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 31
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thành phần các nguồn NPV ký sinh trên một số loài sâu bộ cánh vảy hại rau ở vùng Hà Nội và phụ cận hại rau ở vùng Hà Nội và phụ cận
3.1.1. Thành phần NPV ký sinh trên một số loài sâu bộ cánh vảy hại rau ở vùng Hà Nội và phụ cận vùng Hà Nội và phụ cận
NPV của từng loài sâu hại có nhiều nguồn. Các chủng này có thể rất khác nhau về ựộc tắnh ựối với sâu vật chủ của chúng. Có chủng ựộc tắnh trừ sâu hại rất cao, có chủng lại thấp, ựồng thời có những chủng có thể hoàn toàn không có ựộc tắnh. Các chủng NPV ngoài tự nhiên cũng không ngừng biến ựổi. Các chủng virus ở các ựịa ựiểm khác nhau cũng rất khác nhau về ựộ ựộc do ảnh hưởng của nhiều yếu tố như vật chủ, khắ hậu thời tiết, ựất ựai,Ầ Bên cạnh ựó, ựộc tắnh của các chủng thường giảm ựáng kể sau một thời gian ngắn bảo quản và sử dụng. Việc thu thập và lựa chọn những chủng có ựộc tắnh cao là một việc làm cần ựược tiến hành thường xuyên ựể cung cấp nguồn vật liệu cho việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm trừ sâu từ virus ựồng thời ựưa vào bảo tồn nguồn quỹ gen vi sinh vật.
Như ựã biết, NPV gây bệnh cho côn trùng thuộc 7 bộ trong ựó, bệnh do NPV gây ra trên côn trùng bộ cánh vảy ựược tập trung nghiên cứu rất nhiều. Vì vậy, chúng tôi ựã tiến hành thu thập các mẫu sâu hại bị nhiễm NPV trên rau ở ngoại thành Hà Nội và phụ cận mang về phòng ly tâm và làm sạch. Các mẫu thu thập ựược ựánh số ựể phục vụ cho việc ựánh giá ựộc tắnh và bảo quản.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 32
Bảng 3.1. Thành phần các nguồn NPV thu thập ựược
trên một số loài sâu hại rau vùng Hà Nội và phụ cận (Viện BVTV, 2013)
TT Mẫu Sâu hại vật chủ Cây trồng địa ựiểm
1 HaNPV1 Heliothis armigera - Viện BVTV
2 HaNPV2 Heliothis armigera Cà chua Vân Nội, đông Anh 3 HaNPV3 Heliothis armigera Cà chua đa Tốn, Gia Lâm 4 SlNPV1 Spodoptera litura - Viện BVTV
5 SlNPV2 Spodoptera litura Cải bắp Vân Nội, đông Anh 6 SlNPV3 Spodoptera litura Cải bắp đa Tốn, Gia Lâm 7 SeNPV1 Spodoptera exigua Hành Tây Tựu, Từ Liêm 8 SeNPV2 Spodoptera exigua Hành Thuần Hưng, Khoái
Châu, Hưng Yên
HaNPV1 và SlNPV1 là các nguồn virus chúng tôi kế thừa lại từ các mẫu của các ựề tài nghiên cứu trước ựây của Viện Bảo vệ thực vật. HaNPV1 và SlNPV1 ựã ựược bảo quản lạnh ở -20oC trong 12 năm. 2 mẫu này ựược sử dụng ựể ựánh giá ựộc tắnh song song với các mẫu ựược thu mới khác nhằm mục ựắch kiểm tra ựộ ựộc sau bảo quản và so sánh với ựộc tắnh của các mẫu NPV mới ựược thu thập.
Sâu xanh bị bệnh thu trên cà chua ở Vân Nội, đông Anh và đa Tốn, Gia Lâm. Sâu chết phần cuối thân bám trên cành, ựầu trúc xuống ựất. Các mẫu sâu xanh chết do virus cơ thể mềm nhũn, thân có màu hồng sữa, các ựốt thân bị sưng phồng lên, lớp da ngoài rất dễ vỡ. Khi lớp biểu bì bị nứt vỡ có dịch trắng mùi thối chảy ra ngoài. Sau khi ựã tiến hành tách chiết virus, các nguồn virus này ựược kắ hiệu là HaNPV2 (ựối với nguồn virus thu tại Vân Nội, đông Anh) và HaNPV3 (nguồn virus thu tại đa Tốn, Gia Lâm).
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 33
Các mẫu sâu khoang bị bệnh virus NPV thường hoạt ựộng rất yếu ớt, màu sắc nhạt hơn sâu khỏe. Các ựốt thân bị căng phồng ra, toàn thân như bị trương phù, ựầy nước. Lớp da ngoài mỏng, rất dễ vỡ. Các mô bên trong bị thối rữa, cơ thể mềm nhũn, máu trở nên ựục. Sâu chết có màu nâu sẫm. nhiên, các mẫu sâu khoang bị bệnh cơ thể có màu nâu sẫm. Sâu chết từ dưới cuối bụng dần lên ựến ựầu nên phần cuối thân và ựôi chân sau thường dắnh vào cành lá, ựầu buông thõng xuống ựất. Sâu chết biểu bì nứt vỡ, có dịch thối chảy ra ngoài. Sau khi tách virus từ các mẫu sâu bị bệnh này, các nguồn virus thu tại các 2 ựịa ựiểm trên (bảng 3.1) ựược kắ hiệu là SlNPV2 và SlNPV3.
Tương tự, các mẫu sâu keo da láng bị nhiễm NPV cũng có biểu hiện tương tự là hoạt ựộng yếu ớt, các ựốt thân và toàn cơ thể trương phù, da mỏng rất dễ vỡ, khi vỡ có dịch thối chảy ra ngoài. Cơ thể sâu bị bệnh thường có màu xanh xám. Thường bắt gặp nhiều hơn 1 sâu bệnh trong 1 lá hành. đã tiến hành li tâm và làm sạch NPV thu ựược từ các mẫu sâu bệnh kắ hiệu là SeNPV1 và SeNPV2 tương ứng với 2 nguồn virus ựược thu mới trên sâu xanh da láng hại hành tại Tây Tựu, Từ Liêm và Thuần Hưng, Khoái Châu, Hưng Yên.
Nhận thấy khi so sánh màu sắc và mùi ựặc trưng của các nguồn HaNPV1, SlNPV1 ựã qua bảo quản và các nguồn HaNPV2, HaNPV3, SlNPV2, SlNPV3, SeNPV1, SeNPV2 mới ựược thu thập không nhận thấy có sự khác biệt.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 34
Hình 2. Các nguồn NPV thu thập ựược trên sâu xanh, sâu khoang, sâu keo da láng
Như vậy, ngoài 2 nguồn virus ựã có, chúng tôi ựã thu thập mới ựược 6 nguồn virus tại các ựịa ựiểm khác nhau. Các nguồn virus này ựược sử dụng làm vật liệu nghiên cứu cho nội dung ựánh giá ựộc lực của các nguồn virus trên các loài sâu hại nghiên cứu là sâu xanh, sâu khoang, sâu keo da láng ựồng thời ựưa vào bảo quản ựể bảo tồn nguồn gen vi sinh vật.
3.1.2. Diễn biến bệnh NPV ký sinh trên một số loài sâu bộ cánh vảy hại rau vùng Hà Nội vùng Hà Nội
Cùng với quá trình thu thập các nguồn virus, ựể tìm hiểu về tỷ lệ ký sinh tự nhiên của NPV trên một số ựối tượng sâu hại nghiên cứu, tương quan giữa mật ựộ sâu hại và tỷ lệ sâu hại bị ký sinh do NPV, góp phần ựánh giá vai trò của NPV trong phòng trừ sâu hại rau, chúng tôi ựã tiến hành ựiều tra trên một số loài rau trồng phổ biến vùng Hà Nội, kết quả thể hiện ở bảng 3.2
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 35
Bảng 3.2. Tỷ lệ nhiễm bệnh NPV của sâu xanh Heliothis armigera
trên cà chua tại đông Anh, Hà Nội, vụ ựông xuân 2013
Vụ sớm Chắnh vụ Vụ muộn Giai ựoạn phát triển cây Mật ựộ (con/m2) Tỷ lệ nhiễm NPV (%) Mật ựộ (con/m2) Tỷ lệ nhiễm NPV (%) Mật ựộ (con/m2) Tỷ lệ nhiễm NPV (%) Trồng Ờ 6 lá 0 0 0 0 0 0 Phát triển thân lá 0 0 0 0 0 0 Chớm nụ 0,67 0,15 0,20 0 0,87 8,69 Nụ rộ 1,2 5,55 1,27 7,69 1,40 4,76 Nụ - hoa 1,6 4,16 1,84 5,32 1,93 3,44 Hoa Ờ quả 2,13 3,12 1,87 3,57 2,33 2,85 đậu quả rộ 3,26 4,08 2,20 6,06 3,53 3,77 Quả non 2,86 1,33 2,07 3,22 3,20 2,08 Phát triển quả 1,13 0 0,73 0 2,47 0,67 Bắt ựầu chắn 0,53 0 0,27 0 1,13 0 Chắn rộ 0 0 0 0 0,20 0
Kết quả ựiều tra cho thấy, giai ựoạn cà chua từ trồng- chớm nụ không ghi nhận ựược sự có mặt của sâu xanh. Ở vụ cà chua ựông xuân sớm, từ giai ựoạn cà chua chớm nụ bắt ựầu thấy xuất hiện sâu xanh bị nhiễm NPV, tuy nhiên tỷ lệ này rất thấp, chỉ ựạt 0,15%. Tỷ lệ này tăng dần từ giai ựoạn chớm nụ ựến giai ựoạn ựậu quả rộ, ựạt cao nhất 4,08% sau ựó giảm dần và không phát hiện thấy sâu xanh bị chết nhũn từ giai ựoạn phát triển quả. Mật ựộ sâu xanh cũng tăng dần từ giai ựoạn chớm nụ ựến giai ựoạn ựậu quả rộ, sau ựó lại giảm dần. Như vậy, sự gia tăng giữa tỷ lệ sâu xanh bị bệnh NPV và mật ựộ sâu xanh rất trùng khớp ở các giai ựoạn phát triển của cây cà chua.
Trên cà chua chắnh vụ, tỷ lệ sâu xanh nhiễm NPV lại ựạt cao nhất 7,69% vào thời kỳ nụ rộ. Thời kỳ nụ- hoa, tỷ lệ này giảm còn 5,32%. Sau giai ựoạn
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 36
này, tỷ lệ sâu nhiễm NPV lại tăng dần ựến thời kỳ ựậu quả rộ, từ giai ựoạn phát triển quả, tỷ lệ này giảm. Mật ựộ sâu nhìn chung tăng dần từ ựầu vụ, ựạt ựỉnh cao vào thời kỳ ựậu quả rộ sau ựó giảm dần.
Trong vụ cà chua muộn, tỷ lệ sâu bị bệnh NPV ựạt cao nhất vào thời kỳ chớm nụ (8,69%) do thời kỳ này có ẩm ựộ cao, nhiệt ựộ không quá thấp rất