4. đối tượng và phạm vi nghiên cứu của ựề tài
1.4.2. Nghiên cứu công nghệ nhân nuôi sâu vật chủ
Việc nghiên cứu công nghệ nhân nuôi số lượng lớn sâu hại vật chủ trên môi trường thức ăn nhân tạo ựã ựược nhiều tác giả nghiên cứu. Trung tâm đấu tranh sinh học- Viện BVTV ựã xây dựng quy trình nhân nuôi sâu xanh, sâu khoang, sâu keo da láng trên môi trường thức ăn bán tổng hợp có cải tiến bằng các vật liệu phế thải như bã ựậu, bã bia, lõi ngô, Ầ và hóa chất chống khuẩn, không có agar vừa dễ kiếm, vừa rẻ tiền với khả năng sản xuất hơn 50.000 sâu/tháng với ựiều kiện ựảm bảo nhiệt ẩm ựộ tốt trong phòng nuôi. Tuy nhiên, ở những tháng không thuận lợi, tỷ lệ sâu bị nhiễm bệnh chết còn cao. Các tác giả Nguyễn đậu Toàn, Trần đình Phả và CTV. (1996) ựã nghiên cứu nhân nuôi sâu keo da láng S. exigua trong phòng thắ nghiệm bằng thức ăn nhân tạo. Tuy nhiên việc nhân nuôi sâu keo da láng trong phòng thắ nghiệm gặp nhiều khó khăn. Tất cả các chỉ tiêu về sinh trưởng phát triển ựều thấp. Việc nhân nuôi sâu khoang S. litura bằng thức ăn nhân tạo ựược các tác giả Trương Thanh Giản, Nguyễn đậu Toàn và CTV. (1996) nghiên cứu. đã tạo ựược môi trường thức ăn nhân tạo (có agar và không có agar) bảo ựảm ựược việc nuôi sâu khoang với số lượng lớn trong phòng thắ nghiệm. Thắ nghiệm nuôi sâu lây nhiễm virus cho thấy thời gian từ tháng 3 ựến tháng 10 hàng năm ựều cho tỷ lệ nhiễm virus ựạt từ 84-85%, tỷ lệ nhiễm virus này khá cao, cho phép tiến hành nuôi sâu hàng loạt ựể sản xuất chế phẩm quanh năm (Nguyễn Văn Tuất, 2011).
1.4.3. Nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học NPV
Trung tâm đấu tranh sinh học, Viện Bảo vệ thực vật ựã nghiên cứu sử dụng chế phẩm NPV sâu ựo xanh ựể trừ sâu ựo xanh (Anomis flava) hại ựay
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 22
tại Hà Nội, Hải Hưng. Hiệu quả phòng trừ sâu ựo xanh ựạt 60 Ờ 70 % (Nguyễn Văn Cảm, Hoàng Thị Việt, 1991). Chế phẩm NPV sâu xanh trừ sâu xanh Helicoverpa armigera trên thuốc lá, bông tại đồng Nai ựạt hiệu quả 72%, tại Hà Nội ựạt hiệu quả 50% (Hoàng Thị Việt, 1996). Chế phẩm NPV trừ sâu róm thông trên hàng trăm ha tại Thanh Hóa ựạt hiệu lực 55,2- 83,3%, trừ sâu khoang trên rau, ựậu tương tại Hà Nội ựạt hiệu quả cao. Trung tâm Bông Nha Hố cũng ựã nghiên cứu sử dụng NPV trừ sâu xanh trên bông, trừ sâu keo da láng trên hành tây ựạt hiệu quả cao và số lần phun thuốc hóa học ựã giảm ựi một cách ựáng kể. Ngoài ra, chế phẩm virus NPV sâu keo da láng cũng ựược sử dụng rộng rãi ở Ninh Thuận mang lại hiệu quả kinh tế xã hội cao. Theo Nguyễn Văn Tuất (2005), sử dụng chế phẩm NPV trừ sâu xanh H. armigera ựục quả cà chua tại Hoài đức (Hà Tây) và Tiên Phong (Vĩnh Phúc) ựã cho biết hiệu lực trừ sâu của chế phẩm ựạt 57,7%
Nghiên cứu về tuổi sâu xanh ựem lây nhiễm Ha NPV và nồng ựộ Ha NPV ựể lây nhiễm trong việc sản xuất NPV, Trần Quang Tấn và CTV (1993) cho biết sâu non của sâu xanh ở tuổi 4 và tuổi 5 thắch hợp cho nhiễm bệnh và nồng ựộ Ha NPV lây nhiễm tốt nhất là 2,16 x 107PIB/ml.
Tác giả Hoàng Thị Việt (1996) cho biết, ựem giữ Ha NPV trong tủ lạnh 5-10oC hoặc giữ trong Glycerin ở nhiệt ựộ phòng sau 1 năm hiệu lực NPV vẫn còn tốt. Theo tác giả Nguyễn Văn Cảm (1994) và Hoàng Thị Việt (1996), hiệu lực trừ sâu xanh của chế phẩm Ha NPV trên thuốc lá tương ựương thuốc hóa học trừ sâu. Theo Phạm Thị Thùy (1993), trộn Ha NPV với Bt sẽ làm tăng hiệu lực trừ sâu xanh của Ha NPV.
Công trình ỘNghiên cứu sản xuất sử dụng 7 loại thuốc sâu sinh học ựa chức năng cho một số loại cây trồng bằng kỹ thuật công nghệ sinh họcỢ ựã thu thập chọn lọc các nguồn virus có ựộc tắnh cao ựể sản xuất chế phẩm. đã thu thập ựược 144 mẫu NPV sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xanh (H. armigera),
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 23
sâu khoang (S. litura), sâu cuốn lá lớn (Parnara guttata)Ầ tại các vùng trồng lúa, rau và cây màu. Liên tục nhân nuôi sâu xanh, sâu khoang với số lượng lớn ựể lây nhiễm NPV phục vụ cho việc sản xuất chế phẩm và thắ nghiệm sinh học. đã hoàn thiện công nghệ sản xuất chế phẩm. Các khâu kỹ thuật của quy trình công nghệ ựã ựược cải tiến ựể nâng cao chất lượng chế phẩm, bao gồm tăng cường kỹ thuật nhân nuôi, loại bỏ tạp chất và các vi sinh vật khác ựể ựảm bảo ựộ thuần từ 95 -100%. Cải tiến công nghệ ựể nâng cao nồng ựộ virus từ 4 x 107 PIB/gr lên 1,5 x 109 PIB ựể tiết kiệm công phun rải. Từ công nghệ sản xuất NPV chuyên tắnh có hiệu lực với từng loại sâu hại, nghiên cứu các biện pháp phối trộn nhiều nguồn virus chuyên tắnh khác tạo thành chế phẩm NPV ựa chức năng. Lựa chọn các chủng Bt có hoạt lực cao phối hợp với NPV ựể tạo ựược chế phẩm V-Bt ựa chức năng có hoạt lực cao với sâu hại. Cải tiến công nghệ sản xuất NPV, V-Bt dạng kem thành NPV, V-Bt dạng bột. Nghiên cứu lựa chọn ựược phụ gia ựể nâng cao chất lượng chế phẩm và kéo dài thời gian bảo quản từ 6 tháng lên 24 tháng (Nguyễn Văn Tuất, 2011).
Sử dụng chế phẩm NPV, V-Bt trừ sâu xanh, sâu khoang, sâu tơ hại rau ựạt 75- 89% sau 10 ngày phun thuốc. Hiệu lực của V-Bt có thêm chất phụ gia SD với tỷ lệ 0,02% trừ các loại sâu trên ựạt 66,7- 85,7% sau 5-7 ngày phun thuốc. Hai chế phẩm NPV trừ sâu hại rau màu và cây công nghiệp là sản phẩm của ựề tài do Viện Bảo vệ thực vật thực hiện có tên thương mại:
1. ViS1 1,5 x 109PIB/g bột. Số ựăng ký 03/03/SRN, ngày 12/02/2003 2. ViHa 1,5 x 109PIB/g bột. Số ựăng ký 04/03 SRN ngày 12/02/2003
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 24
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Trang thiết bị, dụng cụ, vật liệu nuôi sâu
- điều hòa nhiệt ựộ, tủ sấy, tủ ựịnh ôn, kắnh lúp, kắnh hiển vi, ựèn khử trùng. - đĩa petri, lọ penicilin, khay nhựa chia ô, buồng ựếm hồng cầu, lam, lamen.
- Lồng nuôi sâu, panh, cối sứ, phễu, ống ựong, cốc ựong,chổi lông, vải màn
2.1.2. Hóa chất
- Glycerin, cồn 96o, NaOH, KOH - Các hóa chất ựể cố ựịnh mẫu virus
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. điều tra, thu thập, phân lập các nguồn NPV ký sinh sâu non bộ cánh vảy hại rau vùng Hà nội và phụ cận vảy hại rau vùng Hà nội và phụ cận
2.2.2. đánh giá ựộc tắnh các nguồn NPV ựã thu thập ựược trên sâu khoang, sâu xanh, sâu keo da láng sâu xanh, sâu keo da láng
2.2.3. Nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn NPV có ựộc tắnh cao ựể phòng trừ sâu xanh ựục quả cà chua, sâu khoang, sâu keo da láng vùng Hà Nội trừ sâu xanh ựục quả cà chua, sâu khoang, sâu keo da láng vùng Hà Nội
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp ựiều tra, thu thập, phân lập các nguồn NPV kắ sinh trên sâu non bộ cánh vảy hại rau vùng Hà Nội và phụ cận trên sâu non bộ cánh vảy hại rau vùng Hà Nội và phụ cận
điều tra diễn biến bệnh NPV trên các loại sâu hại rau bộ cánh vảy phổ biến vùng Hà Nội và phụ cận. Mỗi loại rau ựiều tra 3 ruộng, mỗi ruộng ựiều tra 5 ựiểm chéo góc, mỗi ựiểm 1m2. điều tra 7 ngày 1 lần từ khi trồng ựến thu hoạch.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sâu bệnh và mật ựộ sâu kắ chủ trên ruộng qua các ngày ựiều tra.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 25
Số sâu bệnh
Tỷ lệ sâu bệnh (%) = X 100
Tổng số sâu ựiều tra ựược
Tổng số sâu ựiều tra ựược
Mật ựộ sâu hại (con/m2) = X 100
Tổng diện tắch ựiều tra
Dựa trên những triệu chứng sâu chết bệnh do virus ựể thu thập, nhận xét. Mẫu bệnh thu riêng trong từng lọ thủy tinh nhỏ có nắp kắn, sau ựó loại bỏ sâu chết vì bệnh khác, ựem về phòng thắ nghiệm phân lập và tinh chiết.
- Tinh chiết virus theo phương pháp của Smith (1967). Phương pháp này ựược Hoàng Thị Việt (1996) áp dụng, cụ thể như sau:
+ Cho sâu bệnh vào nước cất (1 mẫu sâu/1ml nước) + để mẫu thối rữa trong vài ngày
+ Nghiền bằng cối sứ nhỏ rồi lọc qua vải mỏng ựể loại bỏ cặn bã
+ Li tâm dịch với tốc ựộ 500 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ cặn phần dưới ống, lấy phần dịch phắa trên. Li tâm tiếp với tốc ựộ 2500 vòng/phút trong 15 phút, lấy phần nước dưới hòa với nước cất rồi li tâm tiếp với tốc ựộ 10.000 vòng/phút từ 2- 3 lần ựể lấy phần lắng màu trắng. đó là các thể vùi của NPV.
- để xác ựịnh hình dạng thể vùi, mẫu ựược cố ựịnh trên lưới ựồng có màng bán thấm Collodion, soi qua kắnh hiển vi ựiện tử và chụp ảnh.
2.3.2. Phương pháp ựánh giá ựộc tắnh các nguồn NPV ựã thu thập ựược trên sâu xanh, sâu khoang, sâu keo da láng trên sâu xanh, sâu khoang, sâu keo da láng
Dùng các nguồn virus ựã thu ựược từ cùng loài sâu hại ựể thắ nghiệm xác ựịnh ựộc tắnh của các nguồn.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 26
Các cá thể sâu nhiễm NPV thu thập ựược ở các ựịa ựiểm khác nhau, trên các loại cây trồng khác nhau ựược phân lập, tinh chiết và lây nhiễm lại trên chắnh vật chủ ựó trong ựiều kiện phòng thắ nghiệm ựể xác ựịnh ựộc lực của từng nguồn gen thu ựược. Các thắ nghiệm ựược tiến hành với 3 công thức tương ứng với 3 nồng ựộ dịch virus khác nhau, phun ựều dịch virus lên thức ăn nuôi sâu, ựể khô và cho sâu ăn. Các công thức thắ nghiệm gồm:
CT1: 106PIB/ml CT2: 3x 106PIB/ml CT3: 6x 106PIB/ml
đối chứng: Phun nước lã.
Mỗi công thức thắ nghiệm nhắc lại 3 lần, mỗi lần 50 cá thể sâu. Sâu thắ nghiệm là sâu tuổi 3. Theo dõi số lượng sâu sống và chết sau 3,5,7,10 ngày xử lý dịch virus.
Chỉ tiêu theo dõi:
Thời gian sâu bị chết bệnh (ngày) Tỷ lệ sâu chết virus (%)
Tỷ lệ sâu vào nhộng (%) Tỷ lệ nhộng vũ hóa (%)
độc tắnh của virus trong ựiều kiện phòng thắ nghiệm ựược ựánh giá thông qua hiệu lực tắnh theo công thức Abbott:
100 % x Ca Ta Ca H − = Trong ựó: H là hiệu lực của NPV (%)
Ca: Số sâu sống ở công thức ựối chứng Ta: Số sâu sống ở công thức thắ nghiệm
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 27
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu khả năng sử dụng NPV ựể phòng trừ sâu xanh ựục quả cà chua, sâu khoang, sâu keo da láng vùng Hà Nội
2.3.3.1. Phương pháp tạo nguồn chế phẩm NPV ựối với sâu hại trên một số cây rau chắnh
Thu nguồn sâu ngoài tự nhiên về nuôi và chọn giống
Nhân nuôi sâu xanh, sâu khoang, sâu keo da láng trên môi trường thức ăn tự nhiên là ngô bao tử, lá thầu dầu và hành hoa. Từ tuổi 1- tuổi 3 ựược nuôi tập thể, từ tuổi 4 ựược nuôi cá thể tại phòng nuôi sâu cách ly với phòng thắ nghiệm ựánh giá ựộc tắnh virus.
Dụng cụ nuôi sâu là các hộp nhựa hình trụ, ựường kắnh 10cm. Miệng hộp ựược ựậy vải màn. Hàng ngày thay thức ăn mới cho sâu. Theo dõi sự sinh trưởng phát triển của sâu vật chủ.
Khi sâu vào nhộng, tiến hành thu và xử lý nhộng bằng dung dịch thuốc tắm 5% trong 5 phút, sau ựó rửa sạch bằng nước cất. để riêng nhộng ựực, cái vào các bình bocan ựậy vải màn. để các bình bocan này ở ựiều kiện phòng thắ nghiệm cho nhộng vũ hóa.
Sau khi trưởng thành vũ hóa, tiến hành ghép cặp. Cho trưởng thành ăn thêm mật ong 5% ựể tăng lượng trứng ựẻ và kéo dài thời gian sống của trưởng thành.
Hình 1. Nhân nuôi sâu vật chủ trong phòng thắ nghiệm (Viện Bảo vệ thực vật, 2012)
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 28
Dùng sâu tuổi 4 ựể nhiễm virus. Phun dịch virus với nồng ựộ 106PIB/ml lên thức ăn nuôi sâu. Sau 4-5 ngày lây nhiễm, thu sâu chết vào các bình thủy tinh có nắp kắn, ựể thối rữa và tiến hành tinh chiết virus theo phương pháp của Smith (ựã nêu trên). Kiểm tra chất lượng dịch virus.
Kiểm tra chất lượng dịch virus bằng cách pha loãng dịch virus sau ựó sử dụng buồng ựếm hồng cầu ựể ựếm thể vùi virus và tắnh theo công thức:
a x 400 x b
X = X 10000
δ Trong ựó: X: Lượng PIB/ml a: tổng số PIB ựếm ựược b: ựộ pha loãng
δ: Số ô to ựã ựếm ựược x 16
2.3.3.2. đánh giá hiệu lực của NPV thu thập ựược trên sâu non bộ cánh vảy trong phòng trừ sâu xanh ựục quả cà chua, sâu khoang, sâu keo da láng ngoài ựồng ruộng
Việc ựánh giá hiệu lực của NPV ựược tiến hành với 3 thắ nghiệm riêng biệt tương ứng với 3 ựối tượng sâu hại cần phòng trừ.
Thắ nghiệm ựánh giá hiệu lực của NPV trên sâu xanh ựục quả cà chua:
Thắ nghiệm gồm 3 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại CT I: Phun HaNPV3 liều lượng 6x 106 PIB/ml
CTII: Phun thuốc hóa học Regent 800WG (hoạt chất Fippronil), nồng ựộ sử dụng 0,2%
CTIII: đối chứng phun nước lã Tiến hành:
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 29
- Pha dịch NPV ở nồng ựộ thắ nghiệm bằng cách sử dụng buồng ựếm hồng cầu (như ựã nêu trên). Phun ướt ựều dịch virus trên toàn bộ cây cà chua trong ô thức thắ nghiệm.
- Thuốc Regent 800WG pha 2gói (mỗi gói 1gr)/bình 16lắt, phun ướt ựều trên toàn bộ cây cà chua trong ô thắ nghiệm.
Thời gian phun vào chiều mát sau 16h bằng bình bơm tay hoặc bình bơm ựộng cơ.
Chỉ tiêu theo dõi: Mật ựộ sâu sống sau 3, 5, 7, 10 ngày phun
Thắ nghiệm ựánh giá hiệu lực của NPV trên sâu khoang hại cải bắp
Thắ nghiệm gồm 3 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại CT I: Phun SlNPV2 liều lượng 6x 106 PIB/ml
CTII: Phun thuốc hóa học Prevathon 5SC (hoạt chất Chlorantranniliprole), nồng ựộ sử dụng 0,0625%
CTIII: đối chứng phun nước lã Tiến hành:
- điều tra mật ựộ sâu trước phun.
- Pha dịch SlNPV2 ở nồng ựộ thắ nghiệm bằng cách sử dụng buồng ựếm hồng cầu (như ựã nêu trên). Phun ướt ựều dịch virus trên toàn bộ cây cải bắp trong ô thức thắ nghiệm.
- Thuốc Prevathon 5SC pha 1gói 10ml/bình 16lắt, phun ướt ựều trên toàn bộ cây cải bắp trong ô thắ nghiệm.
Thời gian phun vào chiều mát sau 16h bằng bình bơm tay hoặc bình bơm ựộng cơ.
Chỉ tiêu theo dõi: Mật ựộ sâu sống sau 3, 5, 7, 10 ngày phun
Thắ nghiệm ựánh giá hiệu lực của NPV trên sâu keo da láng hại hành
Thắ nghiệm gồm 3 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại CT I: Phun SeNPV1 liều lượng 6x 106 PIB/ml
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 30
CTII: Phun thuốc hóa học Angun 5WDG (hoạt chất Emamectinbezoat), nồng ựộ sử dụng 0,0625%
CTIII: đối chứng phun nước lã Tiến hành:
- điều tra mật ựộ sâu trước phun.
- Pha dịch SeNPV1 ở nồng ựộ thắ nghiệm bằng cách sử dụng buồng ựếm hồng cầu (như ựã nêu trên). Phun ướt ựều dịch virus trên toàn bộ hành trong ô thức thắ nghiệm.
- Thuốc Angun 5WDG pha 2gói/bình 16lắt (mỗi gói 5gr)/bình 16lắt, phun ướt ựều trên toàn bộ hành trong ô thắ nghiệm.
Thời gian phun vào chiều mát sau 16h bằng bình bơm tay hoặc bình bơm ựộng cơ.
Chỉ tiêu theo dõi: Mật ựộ sâu sống sau 3, 5, 7, 10 ngày phun
Phương pháp tắnh hiệu lực của các nguồn virus và các loại thuốc hóa học trong thắ nghiệm
Hiệu lực ựược tắnh theo công thức Henderson Ờ Tilton:
100 )