2.1 PHƯƠNG TIỆN
Thời gian: bắt đầu từ tháng 3/2013 đến tháng 12/2013.
Địa điểm: phòng thí nghiệm Nedo thuộc bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ.
Vật liệu và dụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, giấy thấm, kéo, kẹp, sổ ghi chép, tủ cấy, kính hiển vi, tủ úm…
Nguồn nấm Colletotrichum spp. và Aspergillus niger nhận từ Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ.
loại môi trường sử dụng trong nuôi cấy và phân lập gồm môi trường PDA.
Môi trường PDA (pH=6,5-6,8) Khoai tây 200 g Đường Dextrose 20 g
Agar 20 g
Nước cất 1.000 ml
pH 6.7
Nồng độ CaCl2 và dịch trích thực vật được sử dụng trong các thí nghiệm được trình bày trong Bảng 2.1.
Bảng 2. 1 Nồng độ CaCl2 và dịch trích thực vật được sử dụng trong các thí nghiệm
Stt Tên thuốc/dịch trích thực vật Nồng độ 1 2 3 1 CaCl2 20 mM 40 mM 60 mM 2 Lá cây neem 2% 4% 6% 3 Lá cỏ cứt heo 2% 4% 6%
15
2.2 PHƯƠNG PHÁP
Phương pháp thực hiện gồm 3 phần cho mỗi loại nấm.
2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ và các thời gian xử lý của các loại dịch trích thực vật lá Neem, cỏ Cứt Heo và CaCl2 đến sự phát triển khuẩn ty của trích thực vật lá Neem, cỏ Cứt Heo và CaCl2 đến sự phát triển khuẩn ty của nấm Aspergillus niger và Colletotrichum sp
* Mục đích
Đánh giá hiệu quả của các loại dịch trích thực vật đối với hai loại nấm gây bệnh sau thu hoạch.
* Thực hiện thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 10 nghiệm thức (9 nghiệm thức sử dụng dịch trích thực vật/CaCl2 và 1 nghiệm thức đối chứng), 6 lần lặp lại. Loại dịch trích thực vật và nồng độ dịch trích được trình bày trong Bảng 2.1. Nghiệm thức đối chứng là môi trường PDA không có chứa dịch trích thực vật.
Chuẩn bị nguồn nấm Colletotrichum sp và Aspergillus niger: nấm được nuôi cấy trong đĩa petri khoảng 10-15 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm.
Chuẩn bị dịch trích: thu thập phần lá tươi (lá trưởng thành) vào buổi sáng. Thực hiện ly trích: thu mẫu thực vật sau đó rửa sạch hết đất cát, sử dụng máy xay sinh tố nghiền 100 g lá tươi với 100 ml nước cất thanh trùng ở nhiệt độ phòng. Sau đó, rót phần dịch trích thu được qua rây lọc vi khuẩn vào một cốc thủy tinh đã thanh trùng khô. Dùng bọc nilong bao cả bộ cốc thủy tinh và giấy lọc bên trên. Thu được dịch trích có nồng độ chuẩn 100% (Nồng độ dịch trích = Trọng lượng tươi/Lượng nước dùng ly trích) sau đó pha ra các nồng độ 2%, 4%, 6%, tương đương với số ml lần lượt được lấy ra từ dung dịch gốc là 1,9 ml; 3,8 ml; 5,7 ml.
Đối với CaCl22H2O: cân 279,3 mg; 558,6 mg; 837,9 mg tương đương với các nồng độ 20 mM; 40 mM; 60 mM.
Sau đó cho vào trong chai thủy tinh có chứa 95 ml môi trường PDA đã được nấu tan và đạt nhiệt độ khoảng 50-55oC (có thể cầm được chai môi trường bằng tay), lắc chai môi trường để dịch trích hòa tan đều vào môi trường. Sau đó, môi trường trong chai sẽ được đổ vào các đĩa Petri (khoảng 10 ml môi trường/ đĩa petri). Sau khi môi trường đặc lại, đặt các khoanh khuẩn ty nấm đã chuẩn bị vào chính giữa đĩa petri (Dhinggra và Sinclair, 1995) (Hình 2.1).
16
Cách bố trí trên đĩa peptri:
Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thử nghiệm hiệu quả của dịch trích thực vật đối với nấm gây bệnh sau thu hoạch
Chỉ tiêu ghi nhận: ghi nhận đường kính khuẩn lạc của nấm vào các thời điểm 1, 2, 3, 4... ngày sau đặt khoanh khuẩn ty (NSĐKT). Chỉ tiêu được ngừng ghi nhận khi khuẩn lạc của nấm phát triển đến mép đĩa petri.
Hiệu quả của hóa chất được tính theo công thức: (ĐKKLđc – ĐKKLi)
HQT(%) = x 100 ĐKKLđc
Trong đó: ĐKKLđc: Đường kính khuẩn lạc của nghiệm thức đối chứng
ĐKKLi: Đường kính khuẩn lạc của nghiệm thức dịch trích/CaCl2 i
Qua kết quả thí nghiệm 1 sẽ chọn ra 3 nghiệm thức cho hiệu quả ức chế sự phát triển khuẩn ty nấm cao nhất, đại diện cho 2 loại dịch trích và CaCl2 để tiến hành cho thí nghiệm 2 và 3.
2.2.2 Đánh giá hiệu quả của việc xử lý dịch trích lá neem và dịch trích lá cỏ cứt heo, CaCl2 sau khi lây bệnh nhân tạo trên trái heo, CaCl2 sau khi lây bệnh nhân tạo trên trái
* Mục đích
Đánh giá hiệu quả của CaCl2 và dịch trích đối với mầm bệnh đã hiện diện trên trái ớt sau thu hoạch.
* Bố trí thí nghiệm
Khoanh khuẩn ty nấm gây bệnh (đường kính khoảng 5mm)
Môi trường đã có dịch trích thực vật theo nồng độ tính sẵn
17
Các thí nghiệm sẽ được thực hiện với 6 lặp lại, 2 trái/ lặp lại. Chọn các trái đồng đều về kích thước, màu sắc và được xử lý bằng cồn 70o hoặc chlorine trước khi thí nghiệm. Các thí nghiệm được thực hiện theo các phương pháp của Mari và ctv. (2004), Cao và ctv. (2008) và Goncalves và ctv. (2010).
* Cách tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị nguồn nấm Colletotrichum spp. và Aspergillus niger: nấm được nuôi cấy trong đĩa petri khoảng 10-15 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm. Thu bào tử từ mẻ cấy bằng cách thêm vào đĩa đã cấy 5 ml nước cất, bào tử sẽ được lấy nhẹ nhàng từ bề mặt đĩa petri bằng lame và huyền phù này được lọc qua 3 lớp vải thưa để loại bỏ sợi nấm thừa, huyền phù bào tử nấm được xác định mật số bằng lam đếm hồng cầu và pha loãng để đạt được mật số 5 x 106 bào tử/ml.
Chuẩn bị dịch trích thực vật và CaCl2: Các loại dịch trích thực vật được tính toán khối lượng sao cho khi hòa tan với nước cất thanh trùng để đạt dung tích 500 ml để đạt được nồng độ đã chọn từ thí nghiệm 1 (cách tính tương tự như ở thí nghiệm 1) và được chứa trong bình thủy tinh.
Chọn những trái đã đạt độ chín sinh lý, đồng đều về kích thước và màu sắc, về cắt cuống rửa bằng nước sạch để khô tự nhiên sau đó lau trái lại bằng cồn 70oC. Sử dụng bó kim 5 cây tạo vết thương tại vị trí trung tâm (giữa), chủng nhiễm nấm lên vỏ trái với mật số bào tử 5 x 106 bào tử/ml, mỗi vết thương nhỏ 0,2 ml huyền phù bào tử nấm, đặt trái đã chủng nhiễm nấm vào bọc nilông riêng (2 trái/1 bọc) có bổ sung ẩm độ bằng bông gòn (5 ml nước cất/1 bông gòn). Sau đó đem cất giữ tại phòng chủng bệnh. Sau 24 giờ, xử lý trái bằng dịch trích bằng cách ngâm từng trái vào bình thủy tinh chứa 500 ml nước đã chứa nồng độ cần thí nghiệm trong 2 phút, sau đó để khô tự nhiên và để lại vào bọc nilong ban đầu của từng nghiệm thức và cất giữ trong phòng chủng bệnh. Ghi nhận mức độ bệnh bằng cách đo chiều dài vết bệnh theo chiều dài của trái.
2.2.3 Đánh giá hiệu quả của việc xử lý, dịch trích lá neem và dịch trích lá cỏ cứt heo, CaCl2 trước khi lây bệnh nhân tạo trên trái heo, CaCl2 trước khi lây bệnh nhân tạo trên trái
* Mục đích
Đánh giá hiệu quả của việc phòng bệnh của CaCl2 và hai loại dịch trích thực vật đối với mầm bệnh chưa hiện diện trên trái ớt sau thu hoạch.
Bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD). Thí nghiệm được thực hiện với nồng độ và thời gian của CaCl2, dịch trích lá neem và lá cỏ cứt heo xác định từ thí nghiệm 1 và 2, 6 lặp lại (4 nghiệm thức + 6 lặp lại).
18
xử lý dịch trích trước khi chủng bệnh trên trái. Ghi nhận mức độ bệnh bằng cách đo chiều dài vết bệnh theo chiều dài của trái.
2.3 Xử lý thống kê
Các số liệu ghi nhận được tính toán và xử lý trên phần mềm Microsoft Office Excel và phân tích bằng phần mềm thống kê MSTATC qua phép thử DUNCAN.
19