thanh vịt bằng phản ứng trung hòa trên nguyên bào sợi vịt
Phương pháp trung hòa được tiến hành theo Woolcock (1989).
Nguyên lý
Trên đối tượng nuôi cấy (phôi gà, động vật cảm thụ, môi trường tế bào) virus sẽ nhân lên và gây bệnh tích cho các đối tượng trên. Còn khi hỗn hợp virus với kháng thể đặc hiệu tương ứng, chúng sẽ bị trung hòa, không nhân lên được và không gây bệnh tích.
Chuẩn bị
Nguyên bào sợi vịt được nuôi cấy trên đĩa 96 giếng, sau 2-3 ngày mọc thành lớp khoảng 80-90% diện tích bề mặt đáy giếng.
Dịch DHV-1 đã phân lập (subtype DHAV-3) và chuẩn độ gây nhiễm virus với liều 0,1ml chứa TCID50. Sau đó, chúng tôi dùng liều này pha loãng với môi trường nuôi cấy tế bào để thu được dung dịch virus chứa liều 100 TCID50/50µl.
Huyết thanh miễn dịch dương tính là huyết thanh từ vịt con được tạo miễn dịch với DHV-1, chứa kháng thể đặc hiệu kháng DHV-1.
Huyết thanh âm tính là huyết thanh vịt không chứa kháng thề đặc hiệu kháng DHV-1.
Các mẫu huyết thanh vịt thí nghiệm được lấy từ các lô vịt thí nghiệm, sau đó trữ đông -700C.
Tất cả các mẫu huyết thanh được bất hoạt 560C trong 30 phút trước khi thực hiện phản ứng trung hòa virus.
Thực hiện phản ứng
Thí nghiệm được tiến hành trên đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng. Các mẫu huyết thanh được trộn với dịch virus theo tỉ lệ 1:1 về thể tích. Thí nghiệm sử dụng 1 mẫu huyết thanh đối chứng âm, 1 mẫu huyết thanh miễn dịch và các mẫu huyết thanh vịt con được lấy từ các lô thí nghiệm.
-Các mẫu huyết thanh vịt được pha loãng bậc 2 theo cơ số log từ 1/2 đến 1/256 trong môi trường nuôi cấy tế bào MEM, 0% FBS, 50 µl/độ pha loãng.
-Cho 50µl với liều 100 TCID50 DHV-1 vào tất cả các giếng. Trộn đều hỗn hợp huyết thanh và virus, sau đó đem ủ ở 370C trong 1 giờ.
-Cho hỗn hợp sau ủ vào lớp tế bào gan phôi vịt, ủ tiếp 370C trong tủ ấm CO2 khoảng 1 giờ.
30
-Loại hỗn hợp huyết thanh-virus ra khỏi lớp tế bào. Bổ sung môi trường duy trì (MEM, 5% FBS) vào mỗi giếng.
-Tiếp tục ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 trong 2 ngày đến 4 ngày để tiến hành theo dõi. Soi đĩa hàng ngày dưới kính hiển vi để kiểm tra bệnh tích tế bào.
Đánh giá kết quả
Hiệu giá kháng thể trung hòa được thể hiện ở độ pha loãng cao nhất của huyết thanh mà tại đó lớp tế bào còn được bảo hộ, tức là không xuất hiện bệnh tích tế bào ở nồng độ pha loãng tương ứng.
Hiệu giá kháng thể đặc hiệu kháng virus viêm gan vịt type 1 trên 4log2 (độ pha loãng huyết thanh ở 1/16) được xem là hiệu giá kháng thể bảo hộ vịt con kháng lại virus.