Vật liệu thí nghiệm - khảo sát hiệu quả của interf- 123docz.net

Đối tƣợng thí nghiệm

Trứng vịt có phôi được lấy từ đàn vịt bố mẹ nuôi chăn thả, khỏe mạnh, không tiêm ngừa vaccine viêm gan vịt do virus và không chứa kháng thể kháng virus viêm gan vịt type 1. Nguồn vịt được lấy từ hộ chăn nuôi tại ấp An Hương, xã Mỹ An, huyện Mang Thít, tỉnh Vĩnh Long do nơi đây chưa xảy ra bệnh viêm gan vịt do virus. Trong đó, đàn vịt bố mẹ được lấy máu, kiểm tra kháng thể kháng DHV-1 qua phản ứng trung hòa virus và cho kết quả là không có kháng thể kháng DHV-1 lưu hành.

Trứng vịt từ đàn vịt bố mẹ đã kiểm tra là không có kháng thể kháng DHV-1 được đem về và ấp tại Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. Trong đó, vịt con thí nghiệm nở ra là là giống vịt Tàu, không bị nhiễm DHV-1 và không chứa kháng thể DHV-1 và đồng đều nhau ở 1 ngày tuổi. Tổng số lượng vịt thí nghiệm là 140 vịt con.

Dụng cụ, thiết bị và môi trƣờng

Dụng cụ: ống tiêm y tế, ống nghiệm vô trùng, giá đựng ống nghiệm, bình trữ lạnh, type đựng huyết thanh, đĩa 96 giếng, micropipet, dao mổ, kéo, đèn cồn, đĩa petri, lam, paraffin, găng tay, khẩu trang, bông gòn,…

Thiết bị: máy ấp trứng, tủ cấy vô trùng, máy ly tâm lạnh, tủ sấy autoclave, cân,...

Môi trường: dung dịch PBS.

Sinh phẩm

Dịch rChIFN-α và rChIFN-γ (Trung tâm công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh) được bảo quản lạnh ở nhiệt độ là -700

Kháng thể kháng virus viêm gan vịt type 1, virus viêm gan vịt type 1 (nguồn Navetco).

Huyết thanh vịt (lấy từ vịt thí nghiệm).

Hóa chất

Dung dịch PBS, kháng sinh, dung dịch nước muối sinh lý 0,85%, cồn, nước cất, agarose,…

3.3 PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.3.1 Chuẩn bị chuồng nuôi

Chuẩn bị chuồng nuôi: chuồng nuôi là dạng chuồng lồng, xung quanh bao bằng lưới chì, nền chuồng được lót bằng rơm khô. Chuồng được phun thuốc sát trùng cẩn thận trước khi đưa vịt vào nuôi.

Thức ăn: thức ăn nuôi vịt thí nghiệm là thức ăn hỗn hợp của công ty Anco.

Quy trình chăm sóc: vịt con được nuôi úm trên chuồng, trang bị cho mỗi ô chuồng 1 bóng đèn tròn 75W để ủ ấm. Xung quanh khu vực nuôi phải được che chắn cẩn thận để tránh mưa tạt gió lùa.

3.3.2 Bố trí thí nghiệm

3.3.2.1 Xác định nồng độ liều gây chết 50% vịt (LD50) của DHV-1 trên vịt con

Chuẩn bị vịt con: sử dụng vịt con từ đàn bố mẹ khỏe mạnh chưa tiêm

phòng bệnh viêm gan vịt type 1 và không chứa kháng thể kháng virus viêm gan vịt type 1.

Dung dịch: huyễn dịch virus viêm gan vịt type 1 được pha loãng với dung dịch PBS thành những nồng độ lệch nhau 10 lần từ 100

đến 10-6.

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên thông

qua 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 5 vịt con. Tất cả các nghiệm thức được cho uống huyễn dịch virus đã chuẩn bị sẵn lần lượt từ nồng độ 100 đến 10-6.

Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm xác định LD50 của DHV-1 trên vịt con.

Nồng độ pha loãng

virus Số vịt Liều uống

(ml/con) 100 5 0,2 10-1 5 0,2 10-2 5 0,2 10-3 5 0,2 10-4 10-5 5 5 0,2 0,2 10-6 5 0,2

Trong thời gian theo dõi, vịt được chăm sóc, nuôi dưỡng tốt trong cùng một điều kiện nhất định. Tiến hành quan sát và theo dõi vịt ở các nghiệm thức trong vòng 7 ngày. Ghi nhận kết quả.

Cách tính liều LD50: tính liều LD50 dựa vào phương pháp Biometry của Reed & Muench (1938).

Cách tính LD50: LgLD50 = LgLD<50 + dp x lgf Trong đó: dp: khoảng cách tỷ lệ. L<50%: phần trăm tử số chết dưới 50%. L>50%: phần trăm tử số chết trên 50%. lgf: Lg10 = 1 50 – L<50% L>50% – L<50% L>50% L>50% – L<50%) 0% L>50% – L<50%) 0% – L<50%) Dp =

3.3.2.2 Khảo sát độ an toàn của rChIFN-α và rChIFN-γ ở liều 100µg/con vịt

Chuẩn bị vịt con: sử dụng vịt con từ đàn bố mẹ khỏe mạnh chưa tiêm

phòng bệnh viêm gan vịt type 1 và không chứa kháng thể virus viêm gan vịt type 1.

Huyễn dịch sử dụng: dịch rChIFN-α và rChIFN-γvới liều 100µg/con.

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên làm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 5 vịt con. Trong đó ở nghiệm thức thứ nhất, các vịt con sẽ được nhỏ mắt và nhỏ mũi rChIFN-α 100µg/0,1ml/con. Ở nghiệm thức thứ hai các vịt con sẽ được nhỏ mắt, nhỏ mũi rChIFN-γ 100µg/0,1ml/con. Nhóm đối chứng chỉ cho vịt uống 0,1ml PBS. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm đánh giá độ an toàn của rChIFN-α và rChIFN-γ ở liều 100µg/con vịt Nghiệm thức Số vịt thí nghiệm (con) Số lần lặp lại Liều/con Đƣờng cấp rChIFN-α 5 3 100µg Nhỏ mắt và mũi rChIFN-γ 5 3 100µg Nhỏ mắt và mũi PBS 5 3 0,1ml Nhỏ mắt và mũi

Ghi chú: rChIFN: Interferon gà tái tổ hợp.

ĐC PBS: vịt không sử dụng rChIFNs, chỉ cho uống PBS.

Theo dõi vịt thí nghiệm 1 tuần lễ. Ghi nhận tình trạng sức khỏe, tỷ lệ vịt sống, tỷ lệ vịt chết trong các lô thí nghiệm.

Tỷ lệ vịt chết (%) =

3.3.2.3 Khảo sát hoạt tính kháng DHV-1 của rChIFN-α và rChIFN-γ trên vịt con

Chuẩn bị vịt con: vịt thí nghiệm ấp nở từ trứng những vịt bố mẹ khỏe mạnh, không tiêm vaccine phòng bệnh viêm gan vịt type 1 và không nhiễm virus viêm gan vịt type 1.

Huyễn dịch sử dụng: dịch virus viêm gan vịt type 1 liều 103LD50 và dịch rChIFN-α, rChIFN-γvới liều 100µg/con.

Số vịt chết

Tổng số vịt thí nghiệm

Bố trí thí nghiệm

Trước khi bố trí thí nghiệm, chúng tôi tiến hành chuẩn độ để xác định liều gây chết 50% vịt con thí nghiệm 1 ngày tuổi.

Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên làm 8 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 5 con vịt con. Trong đó:

- Tất cả các nghiệm thức được đánh số lần lượt từ 1 đến 8. Đầu tiên, 7 nghiệm thức được đánh số từ 1 đến 7 sẽ được nhỏ mắt, mũi 0,2ml/con dịch DHV-1 với liều 103LD50.

- Sau 24 giờ, nghiệm thức 1,2,3 sẽ được nhỏ mắt, mũi rChIFN-α với hàm lượng lần lượt là 10μg, 50μg và 100μg/0,1ml/con. Cùng thời điểm đó, nghiệm thức 4,5,6 được nhỏ mắt, mũi rChIFN-γ với hàm lượng 10μg, 50μg và 100μg/0,1ml/con.

- Nghiệm thức 7_ nghiệm thức đối chứng dương chỉ sử dụng dịch DHV- 1 lúc đầu mà không được điều trị bằng dịch rChIFNs.

- Nghiệm thức 8_nghiệm thức đối chứng âm không sử dụng rChIFNs, không gây nhiễm virus, chỉ cho uống 0,2ml PBS.

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type 1 của rChIFN-α và rChIFN-γ trên vịt con.

Nghiệm thức Số vịt thí nghiệm (con) Số lần lặp lại Gây nhiễm DHV-1 (0,2ml/con) Sử dụng rChIFN 1 5 3 103LD50 10μg rChIFN-α 2 5 3 103LD50 50μg rChIFN-α 3 5 3 103LD50 100μg rChIFN-α 4 5 3 103LD50 10μg rChIFN-γ 5 5 3 103LD50 50μg rChIFN-γ 6 5 3 103LD50 100μg rChIFN-γ ĐC (+) 5 3 10 3LD50 - ĐC (-) 5 - 0,2ml PBS -

Ghi chú: rChIFN: Interferon gà tái tổ hợp. ĐC (+): đối chứng dương. ĐC (-): đối chứng âm.

Trong thời gian thí nghiệm, vịt được chăm sóc, nuôi dưỡng tốt trong cùng một điều kiện nhất định.

Theo dõi tình trạng sức khỏe vịt trong 7 ngày sau khi gây nhiễm virus. Ghi nhận tỷ lệ vịt bệnh, tỷ lệ vịt chết ở các lô thí nghiệm.

Tỷ lệ vịt chết (%) =

Tỷ lệ vịt bệnh(%) =

Sau thời gian theo dõi, tất cả vịt được lấy huyết thanh và giữ ở -80o C. Các mẫu huyết thanh này sẽ được sử dụng để xác định hiệu giá kháng thể kháng DHV-1 bằng phản ứng trung hòa virus.

Tỷ lệ mẫu huyết thanh dương tính với kháng thể đặc hiệu kháng DHV-1 (%)

3.3.2.4 Thí nghiệm khảo sát tính kháng virus của rChIFN-α kết hợp với rChIFN-γ đối với DHV-1 trên vịt con

Mục tiêu: đánh giá tính kháng virus DHV-1 của rChIFN-α kết hợp rChIFN-γ trên vịt con.

Chuẩn bị vịt con: vịt thí nghiệm ấp nở từ trứng những vịt bố mẹ khỏe mạnh, không tiêm vaccine phòng bệnh viêm gan vịt và không có kháng thể kháng virus viêm gan vịt type 1.

Huyễn dịch sử dụng: dịch virus DHV-1 với liều gây chết 50% vịt con

và dịch rChIFN-α, rChIFN-γ với liều 100µg/con được cấp qua đường nhỏ mắt và nhỏ mũi.

Từ kết quả của thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type 1 của rChIFN-α và rChIFN-γ trên vịt con, chọn ra 2 liều rChIFN đạt hiệu quả cao nhất tiến hành thử nghiệm.

Số vịt chết Tổng số vịt thí nghiệm × 100 Số mẫu dương tính Số mẫu xét nghiệm × 100 = Số vịt mắc bệnh Tổng số vịt thí nghiệm × 100

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên làm 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 5 con vịt. Trong đó:

- Tất cả các nghiệm thức được đánh số từ 1 đến 6.

- Nghiệm thức 1, 2, 3, 4 được cho uống dịch DHV-1 với liều gây nhiễm 103LD50. Sau 24h, các nghiệm thức này được nhỏ mắt, mũi 0,1ml rChIFNs với liều lần lượt là 50µg rChIFN-α +1µg rChIFN-γ, 50µg rChIFN-α + 10µg rChIFN-γ, 100µg rChIFN-α + 1µg rChIFN-γ, 100µg rChIFN-α + 10µg rChIFN-γ.

-Nghiệm thức ĐC (+) cho vịt thí nghiệm uống 0,2ml dịch DHV-1 với liều 103

LD50và không điều trị bằng rChIFNs.

-Nghiệm thức ĐC(-) vịt thí nghiệm không được gây nhiễm virus, chỉ cho uống 0,2ml dung dịch PBS.

Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát tính kháng virus của rChIFN-α kết hợp với rChIFN-γ trên vịt con

Ghi chú: rChIFN: Interferon gà tái tổ hợp. ĐC (+): đối chứng dương. ĐC (-): đối chứng âm.

Theo dõi tình trạng sức khỏe của vịt trong 1 tuần sau khi gây nhiễm virus. Ghi nhận tỷ lệ vịt nhiễm bệnh, tỷ lệ vịt chết ở các lô thí nghiệm.

Tỷ lệ vịt mắc bệnh (%) = Tỷ lệ vịt chết (%) = Nghiệm thức Số vịt thí nghiệm (con) Số lần lặp lại Liều DHV1 (0,2ml/con)

Sau 24h cung cấp rChIFN Loại rChIFN mắt, mũi/con Liều nhỏ

1 5 3 103LD50 rChIFN-α + rChIFN- γ 50µg + 1µg 2 5 3 103LD50 rChIFN-α + rChIFN- γ 50µg + 10µg 3 5 3 103LD50 rChIFN-α + rChIFN- γ 100µg + 1µg 4 5 3 103LD50 rChIFN-α + rChIFN- γ 100µg + 10µg ĐC (+) 5 3 103LD50 - - ĐC (-) 5 0,2ml PBS - - Số vịt chết Tổng số vịt thí nghiệm × 100 Số vịt mắc bệnh Tổng số vịt thí nghiệm × 100

Tỷ lệ mẫu huyết thanh dương tính

với kháng thể đặc hiệu kháng DHV-1 (%)

3.3.2.5 Thí nghiệm khảo sát hiệu quả của liều kết hợp trong phòng bệnh DHV-1 trên vịt con

Mục tiêu: khảo sát hiệu quả kháng virus ở liều kết hợp của rChIFN-α với rChIFN-γ trong phòng bệnh viêm gan vịt do virus type 1.

Từ kết quả thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng virus của rChIFN-α kết hợp với rChIFN-γ. Chọn 2 nghiệm thức đạt hiệu quả cao nhất tiến hành thử nghiệm.

Bố trí thí nghiệm

Tiến hành chuẩn độ, xác định độc lực của virus DHV-1 trên vịt con bằng cách xác định nồng độ liều gây chết 50% vịt thí nghiệm.

Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 5 vịt con. Trong đó:

- Nghiệm thức 1: vịt con được nhỏ mắt nhỏ mũi rChIFN-α kết hợp với rChIFN- γ ở hàm lượng 0,1ml/con ở liều 100µg rChIFN-α + 1µg rChIFN-γ. Vịt được nhỏ mắt nhỏ mũi liên tục trong 3 ngày, mỗi ngày một liều.

- Nghiệm thức 2: vịt con được nhỏ mắt nhỏ mũi rChIFN-α kết hợp với rChIFN- γ ở hàm lượng 0,1ml/con với liều 100µg rChIFN-α + 10µg rChIFN- γ. Vịt được nhỏ mắt nhỏ mũi liên tục trong 3 ngày, mỗi ngày một liều.

- Sau 24h từ khi nhỏ mắt nhỏ mũi rChIFN ở liều thứ 1, số vịt thí nghiệm ở nghiệm thức 1 và nghiệm thức 2 được cho uống 0,2ml dịch DHV-1 với liều gây nhiễm 103LD50.

- Nghiệm thức 3 là nghiệm thức đối chứng dương cho nhỏ mắt, nhỏ mũi 0,2ml dịch DHV-1 với liều gây nhiễm 103LD50 và không cho uống rChIFN.

- Nghiệm thức 4 là nghiệm thức đối chứng âm không gây nhiễm virus, chỉ cho uống 0,2ml dung dịch PBS.

Số mẫu dương tính Số mẫu xét nghiệm

× 100

Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát liều thích hợp phòng bệnh viêm gan vịt type 1 của rChIFN-α kết hợp với rChIFN-γ trên vịt con

Nghiệm thức Số vịt thí nghiệm (con) Số lần

lặp lại Liều nhỏ mắt nhỏ mũi 0,1ml/con

Liều gây nhiễm DHV-1 (0,2ml/con) 1 5 3 100µg rChIFN-α + 1µg rChIFN- γ. 10 3 LD50 2 5 3 100µg rChIFN-α + 10µg rChIFN- γ 10 3 LD50 ĐC (+) 5 3 - 103LD50 ĐC (-) 5 3 0,2ml dd PBS -

Ghi chú: rChIFN: Interferon gà tái tổ hợp. ĐC (+): đối chứng dương. ĐC (-): đối chứng âm.

Theo dõi tình trạng sức khỏe của vịt trong 3 tuần sau khi gây nhiễm virus, cân vịt 2 ngày/lần. Ghi nhận tăng trọng, tỷ lệ vịt nhiễm bệnh, tỷ lệ vịt chết ở các lô thí nghiệm.

Tỷ lệ vịt nhiễm bệnh (%) =

Tỷ lệ vịt chết (%) =

Sau thời gian theo dõi, tất cả vịt được lấy huyết thanh và giữ ở -80oC. Các mẫu huyết thanh này sẽ được sử dụng để xác định hiệu giá kháng thể kháng viêm gan bằng phản ứng trung hòa virus.

Tỷ lệ mẫu huyết thanh dương tính

với kháng thể đặc hiệu kháng DHV-1 (%) Số vịt chết Tổng số vịt thí nghiệm × 100 Số mẫu dương tính Số mẫu xét nghiệm × 100 = = Số vịt mắc bệnh Tổng số vịt thí nghiệm × 100

3.4 Phản ứng trung hòa: Phƣơng pháp kiểm tra kháng thế huyết thanh vịt bằng phản ứng trung hòa trên nguyên bào sợi vịt thanh vịt bằng phản ứng trung hòa trên nguyên bào sợi vịt

Phương pháp trung hòa được tiến hành theo Woolcock (1989).

Nguyên lý

Trên đối tượng nuôi cấy (phôi gà, động vật cảm thụ, môi trường tế bào) virus sẽ nhân lên và gây bệnh tích cho các đối tượng trên. Còn khi hỗn hợp virus với kháng thể đặc hiệu tương ứng, chúng sẽ bị trung hòa, không nhân lên được và không gây bệnh tích.

Chuẩn bị

Nguyên bào sợi vịt được nuôi cấy trên đĩa 96 giếng, sau 2-3 ngày mọc thành lớp khoảng 80-90% diện tích bề mặt đáy giếng.

Dịch DHV-1 đã phân lập (subtype DHAV-3) và chuẩn độ gây nhiễm virus với liều 0,1ml chứa TCID50. Sau đó, chúng tôi dùng liều này pha loãng với môi trường nuôi cấy tế bào để thu được dung dịch virus chứa liều 100 TCID50/50µl.

Huyết thanh miễn dịch dương tính là huyết thanh từ vịt con được tạo miễn dịch với DHV-1, chứa kháng thể đặc hiệu kháng DHV-1.

Huyết thanh âm tính là huyết thanh vịt không chứa kháng thề đặc hiệu kháng DHV-1.

Các mẫu huyết thanh vịt thí nghiệm được lấy từ các lô vịt thí nghiệm, sau đó trữ đông -700C.

Tất cả các mẫu huyết thanh được bất hoạt 560C trong 30 phút trước khi thực hiện phản ứng trung hòa virus.

Thực hiện phản ứng

Thí nghiệm được tiến hành trên đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng. Các mẫu huyết thanh được trộn với dịch virus theo tỉ lệ 1:1 về thể tích. Thí nghiệm sử dụng 1 mẫu huyết thanh đối chứng âm, 1 mẫu huyết thanh miễn dịch và các mẫu huyết thanh vịt con được lấy từ các lô thí nghiệm.

-Các mẫu huyết thanh vịt được pha loãng bậc 2 theo cơ số log từ 1/2 đến 1/256 trong môi trường nuôi cấy tế bào MEM, 0% FBS, 50 µl/độ pha loãng.

-Cho 50µl với liều 100 TCID50 DHV-1 vào tất cả các giếng. Trộn đều