Virus viêm gan vịt có sức đề kháng rất cao. Chúng đề kháng với ether, chloroform, chịu được sức nóng tương đối và có khả năng tồn tại lâu trong điều kiện môi trường thông thường. Trong điều kiện tự nhiên, virus có thể sống đến 10 tuần, trong môi trường nhiễm bẩn và trong phân hơn 37 ngày. Virus có thể sống sót trong 2 năm ở 40C và 9 năm ở -200C.
Virus bị bất hoạt hoàn toàn với chloramines 3% trong 5 giờ, formalin 0,2% trong 2 giờ, phenol 5% và dung dịch sodium hypochlorite trong 8 giờ. Xét về nhiệt độ, virus viêm gan vịt bị bất hoạt ở 560C sau 30 phút, nhưng sau 23 giờ thì virus mới bị bất hoạt hoàn toàn (Nguyễn Đức Hiền, 2012).
2.6.3 Truyền nhiễm học 2.5.3.1 Loài mắc bệnh
Viêm gan vịt type 1 thường xảy ra trên vịt dưới 6 tuần tuổi, đặc biệt là đối với vịt con từ 1-3 tuần tuổi. Vịt xiêm con và ngỗng dưới 6 tuần sẽ không mắc bệnh trong tự nhiên (OIE, 2010).
Một số loài vịt hoang dã như le le, vịt trời là những vật mang trùng, những động vật này khi di cư có thể mang virus đi xa hàng ngàn kilomet, chúng bài thải virus theo phân vào nguồn nước và làm lây lan bệnh (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012).
15
2.5.3.2 Phương thức truyền lây
Bệnh có thể truyền lây qua đường tiêu hóa, hô hấp và vết thương ở da. Vịt bệnh luôn bài xuất virus ra môi trường bên ngoài theo phân, nước mũi vào thức ăn, nước uống, chất độn chuồng, dụng cụ chăn nuôi, máy ấp,…lây nhiễm sang vịt khác (Nguyễn Xuân Bình et al., 2005).
Virus có thể lây lan đến các nơi xa hơn do loài chim hoang dại mang virus viêm gan vịt từ vùng này bay sang vùng khác. Ngoài ra, chuột cống nâu cũng có thể là nguồn vật chủ dự trữ virus viêm gan vịt type 1.
Bệnh lây truyền dễ dàng qua đường tiêm bắp thịt và cho ăn virus phân lập từ trứng. Thời kì ủ bệnh 24 giờ, gần như tất cả đều chết vào ngày thứ 4. Những vịt con khi tiêm truyền cũng bị lây và chết chậm hơn vịt được tiêm virus (Levine and Fabricant, 1957).
2.5.3.3 Cơ chế sinh bệnh
Virus xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hóa, đường hô hấp hoặc qua vết thương rồi vào máu. Virus theo máu đến các phủ tạng, đặc biệt là ở gan. Dưới tác động của virus, quá trình trao đổi chất ở gan bị rối loạn, lượng glycogen ở gan giảm thấp, lượng lipid tăng do quá trình trao đổi cholesterol bị đình trệ. Do đó, vịt con mắc bệnh bị thiếu năng lượng và sức đề kháng bị giảm sút. Sau đó, virus trực tiếp phá hoại tế bào gan và các tế bào nội mô huyết quản gây nên hoại tử và xuất huyết. Tổ chức gan bị phá hoại, gan không giải độc được và con vật bị chết do bị ngộ độc (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012).
2.5.3.4 Triệu chứng
Khi nhiễm virus type 1, bệnh thường thấy ở thể quá cấp và vịt con chết đột ngột trong vòng 1-2 giờ sau khi nhiễm. Thời gian nung bệnh thường 1-2 ngày (Nguyễn Đức Lưu và Vũ Như Quán, 2002).
Vịt con lúc đầu nhiễm bệnh có biểu hiện đi đứng chậm chạp, thường không theo kịp đàn. Sau một thời gian ngắn, vịt không đi lại được, nằm bẹp, nhắm mắt, bỏ ăn sã cánh, một số bị tiêu chảy. Sau một vài giờ niêm mạc xanh tím, vịt bị co giật, nằm la liệt, nghiêng sườn hoặc nằm ngửa, chân duỗi thẳng, đầu ngoẹo sang sườn hoặc lên lưng. Ngoài ra, vịt còn có thể rơi vào trạng thái hôn mê, mất điều hòa, vịt giảm cân và có những cơn co thắt trước khi chết (Trần Thị Liên et al., 2005).
Đối với những bệnh ở thể mãn tính, vịt có thể bị nhiễm mầm bệnh kế phát từ Salmonella, vịt bệnh ủ rũ cao độ và tiêu chảy.
16
Hình 2.5 Vịt chết tƣ thế đầu ngoẹo ra sau
(Nguồn http://nanovet.com.vn/SiteIndex.aspx?Function=DetailsBenhDieuTri&Id=16)
2.5.3.5 Bệnh tích
Bệnh tích đại thể
Bệnh tích chủ yếu tập trung ở gan: gan viêm, sưng to, nhũn, dễ bị nát khi ấn nhẹ. Trên bề mặt gan có xuất huyết lấm tấm hay thành từng đám màu đỏ sẫm hoặc đỏ tím (Nguyễn Văn Cảm et al., 2001). Các nốt xuất huyết cũng có thể được quan sát ở mặt dưới của gan. Bên cạnh các điểm xuất huyết còn thấy các điểm tụ máu đỏ hoặc những đám màu vàng nhạt do tổ chức gan bị thoái hóa.
Ngoài bệnh tích gan còn thấy các bệnh tích thường gặp là: lách sưng phù, đôi khi xuất hiện những điểm trắng hoại tử. Các mạch máu ở thận sung huyết. Cơ tim nhợt nhạt, màng bao tim và túi khí bị viêm, thận tụ huyết nhẹ, lách hơi sưng (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012).
Hình 2.6 Gan sƣng to, nhạt màu, xuất huyết
17
Bệnh tích vi thể
Bệnh biến đổi chủ yếu là hoại tử tế bào gan và sự tăng các tế bào biểu mô ống mật. Có sự thay đổi mức độ viêm tế bào và xuất huyết xảy ra. Các mức độ phản ứng viêm khác nhau, xuất hiện nhiều tế bào viêm đơn nhân ở quanh ống mật và tập trung thành từng đám ở nhu mô gan. Hồng cầu thoát ra ngoài mạch quản tràn lan với tỷ lệ lên đến 100% (Nguyễn Văn Cảm et al., 2001). Mặc khác, theo nhận định của Levine (1972) thì sự tái sinh nhu mô gan được quan sát ở vịt con không chết.
2.5.3.6 Chẩn đoán
Chẩn đoán lâm sàng
Dựa vào đặc điểm dịch tễ là bệnh truyền nhiễm cấp tính, xảy ra ở vịt dưới 6 tuần tuổi. Vịt con dưới 3 tuần tuổi khi mắc bệnh viêm gan do virus có tỷ lệ chết rất cao, từ 50% đến 95%. Vịt từ 4 tuần tuổi đến 5 tuần tuổi khi mắc bệnh thì tỷ lệ chết rất thấp hoặc không đáng kể.
Vịt con chết nhanh, co giật, lúc chết đầu ngoẹo ra sau hoặc là một bên, hai chân duỗi thẳng được coi là dấu hiệu đặc biệt của bệnh viêm gan vịt do virus.
Chẩn đoán virus học
Bệnh phẩm là gan, não của vịt pha với nước sinh lý thành huyễn dịch 20%, xử lý bằng kháng sinh diệt tạp khuẩn, lấy nước trong rồi gây nhiễm cho phôi. Tiêm 0,2 ml huyễn dịch vào xoang niệu mô hoặc màng CAM của phôi gà 8-10 ngày tuổi hoặc phôi vịt 10-14 ngày tuổi. Nếu huyễn dịch có chứa virus thì phôi chết. Đối với phôi gà thì thường gây chết phôi sau 5-8 ngày tiêm và phôi vịt từ 3-5 ngày sau khi tiêm (Trần Thị Liên et al., 2005). Mổ khám thấy bệnh tích đặc trưng trên phôi như sau: phôi còi cọc, xuất huyết toàn thân, phù nề ở bụng. Gan của phôi có màu đỏ hoặc vàng, xuất huyết và hoại tử rất rõ. Đối với phôi chết muộn hơn, dịch niệu có màu xanh lục.
Chẩn đoán huyết thanh học
Chẩn đoán huyết thanh học không hữu ích trong các đợt dịch viêm gan vịt type 1 cấp tính. Tuy nhiên, các xét nghiệm huyết thanh học được sử dụng cho các mục đích khác như giám định virus, chuẩn độ hiệu giá kháng thể trung hòa virus sau tiêm vaccine hoặc được sử dụng cho các đợt khảo sát dịch tễ học (Nguyễn Đức Hiền, 2012).
18
Khi virus bị kháng thể đặc hiệu kết hợp sẽ không còn khả năng gây bệnh nên phản ứng kết hợp giữa virus với kháng thể được gọi là phản ứng trung hòa virus. Người ta có thể dùng kháng huyết thanh liệu pháp (huyết thanh miễn dịch có chứa kháng thể đặc hiệu) để can thiệp vào ổ dịch do virus gây ra. Lúc này sự trung hòa virus xảy ra ngay sau khi tiêm huyết thanh miễn dịch vào cơ thể và con vật không còn bị virus gây bệnh được nữa.
Với mục đích chẩn đoán virus trong phòng thí nghiệm in vitro, người ta có thể thực hiện phản ứng trung hòa virus trên phôi, trên động vật cảm thụ, và trên môi trường tế bào nuôi cấy. Nguyên lý cơ bản của phản ứng trung hòa là trên đối tượng nuôi cấy (phôi, động vật cảm thụ, môi trường tế bào) virus sẽ nhân lên và gây bệnh tích cho các đối tượng trên, còn khi hỗn hợp virus với kháng thể đặc hiệu tương ứng, chúng sẽ bị trung hòa, không nhân lên được và không gây bệnh tích.
2.6.3.7 Phòng bệnh
Phòng bệnh bằng vệ sinh
Sát trùng chuồng trại chăn nuôi, dụng cụ chăn nuôi thường xuyên bằng formol 1% hoặc NaOH 3%. Nên tự túc con giống, trứng ấp từ đàn bố mẹ khỏe mạnh.
Phải đảm bảo nguyên tắc chống bệnh nhằm cắt đứt một trong 3 khâu của quá trình sinh dịch.
Tiêu hủy xác chết, cách ly vịt bệnh. Chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi, môi trường xung quanh phải sát trùng kỹ càng. Cấm vận chuyển mua bán vịt, trứng để tránh lây lan. Vịt bệnh phải được cách ly.
Dùng kháng huyết thanh hoặc vaccine tiêm cho đàn vịt để loại những con đang nung bệnh và những con ốm, đồng thời tạo miễn dịch nhanh chóng cho những vịt chưa mắc bệnh.
Phòng bệnh bằng vaccine
Khi bệnh mang tính chất địa phương thì tiêm phòng bằng vaccine với chủng virus nhược độc là biện pháp tốt nhất.
Với vịt con mới nở không có kháng thể thụ động do mẹ truyền mà được nuôi trong vùng có dịch thì cần tiêm vaccine trước khi đưa về nuôi, nên tiêm lúc vịt 1 ngày tuổi với liều 0,2 ml/con vào dưới da.
Với vịt sinh sản, tiêm vaccine tạo trạng thái miễn dịch cao để vịt mẹ truyền kháng thể cho vịt con qua trứng. Tiến hành tiêm vaccine 2 lần cách nhau 4-6 tuần, mỗi lần 0,5-1ml vaccine vào bắp thịt. Lần tiêm thứ 2 vào thời
19
điểm vịt bắt đầu đẻ, sau đó cứ 6 tháng tái chủng 1 lần (Nguyễn Bá Hiên, 2007).
2.6.3.8 Điều trị
Kháng sinh không có hiệu quả trong điều trị. Khi có vịt bệnh xảy ra cần loại thải ngay các vịt bệnh, sử dụng huyết thanh từ các vịt đã khỏi bệnh tiêm cho vịt khỏe còn lại liều 0,5ml/con, hoặc có thể sử dụng kháng thể K.T.V (Hanvet) có bán sẵn trên thị trường với liều 0,5-1ml/con (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012).
Việc cho vịt uống interferon và bổ sung chất điện giải, chất giả độc gan như Sorpheron (1ml/1 lít nước) làm giảm tỉ lệ chết đáng kể. Tiêm vaccine nhược độc giúp loại bỏ những vịt đang nung bệnh, những vịt mắc bệnh đồng thời tạo miễn dịch nhanh chóng.
20
Chƣơng 3
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Xác định liều gây chết 50% vịt con của DHV-1.
Khảo sát tính an toàn của rChIFN-α và rChIFN-γ trên vịt con.
Khảo sát tính kháng virus của rChIFN-α và rChIFN-γ riêng rẽ và kết hợp trên vịt con.
3.2 PHƢƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM
3.2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Thời gian: từ tháng 08/2014 đến tháng 12/2014.
Địa điểm: Trại chăn nuôi thực nghiệm và Phòng thí nghiệm virus học, Bộ môn Thú Y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
3.2.2 Vật liệu thí nghiệm Đối tƣợng thí nghiệm Đối tƣợng thí nghiệm
Trứng vịt có phôi được lấy từ đàn vịt bố mẹ nuôi chăn thả, khỏe mạnh, không tiêm ngừa vaccine viêm gan vịt do virus và không chứa kháng thể kháng virus viêm gan vịt type 1. Nguồn vịt được lấy từ hộ chăn nuôi tại ấp An Hương, xã Mỹ An, huyện Mang Thít, tỉnh Vĩnh Long do nơi đây chưa xảy ra bệnh viêm gan vịt do virus. Trong đó, đàn vịt bố mẹ được lấy máu, kiểm tra kháng thể kháng DHV-1 qua phản ứng trung hòa virus và cho kết quả là không có kháng thể kháng DHV-1 lưu hành.
Trứng vịt từ đàn vịt bố mẹ đã kiểm tra là không có kháng thể kháng DHV-1 được đem về và ấp tại Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. Trong đó, vịt con thí nghiệm nở ra là là giống vịt Tàu, không bị nhiễm DHV-1 và không chứa kháng thể DHV-1 và đồng đều nhau ở 1 ngày tuổi. Tổng số lượng vịt thí nghiệm là 140 vịt con.
21
Dụng cụ, thiết bị và môi trƣờng
Dụng cụ: ống tiêm y tế, ống nghiệm vô trùng, giá đựng ống nghiệm, bình trữ lạnh, type đựng huyết thanh, đĩa 96 giếng, micropipet, dao mổ, kéo, đèn cồn, đĩa petri, lam, paraffin, găng tay, khẩu trang, bông gòn,…
Thiết bị: máy ấp trứng, tủ cấy vô trùng, máy ly tâm lạnh, tủ sấy autoclave, cân,...
Môi trường: dung dịch PBS.
Sinh phẩm
Dịch rChIFN-α và rChIFN-γ (Trung tâm công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh) được bảo quản lạnh ở nhiệt độ là -700
C.
Kháng thể kháng virus viêm gan vịt type 1, virus viêm gan vịt type 1 (nguồn Navetco).
Huyết thanh vịt (lấy từ vịt thí nghiệm).
Hóa chất
Dung dịch PBS, kháng sinh, dung dịch nước muối sinh lý 0,85%, cồn, nước cất, agarose,…
3.3 PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.3.1 Chuẩn bị chuồng nuôi
Chuẩn bị chuồng nuôi: chuồng nuôi là dạng chuồng lồng, xung quanh bao bằng lưới chì, nền chuồng được lót bằng rơm khô. Chuồng được phun thuốc sát trùng cẩn thận trước khi đưa vịt vào nuôi.
Thức ăn: thức ăn nuôi vịt thí nghiệm là thức ăn hỗn hợp của công ty Anco.
Quy trình chăm sóc: vịt con được nuôi úm trên chuồng, trang bị cho mỗi ô chuồng 1 bóng đèn tròn 75W để ủ ấm. Xung quanh khu vực nuôi phải được che chắn cẩn thận để tránh mưa tạt gió lùa.
3.3.2 Bố trí thí nghiệm
3.3.2.1 Xác định nồng độ liều gây chết 50% vịt (LD50) của DHV-1 trên vịt con
Chuẩn bị vịt con: sử dụng vịt con từ đàn bố mẹ khỏe mạnh chưa tiêm
phòng bệnh viêm gan vịt type 1 và không chứa kháng thể kháng virus viêm gan vịt type 1.
22
Dung dịch: huyễn dịch virus viêm gan vịt type 1 được pha loãng với dung dịch PBS thành những nồng độ lệch nhau 10 lần từ 100
đến 10-6.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên thông
qua 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 5 vịt con. Tất cả các nghiệm thức được cho uống huyễn dịch virus đã chuẩn bị sẵn lần lượt từ nồng độ 100 đến 10-6.
Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm xác định LD50 của DHV-1 trên vịt con.
Nồng độ pha loãng
virus Số vịt Liều uống
(ml/con) 100 5 0,2 10-1 5 0,2 10-2 5 0,2 10-3 5 0,2 10-4 10-5 5 5 0,2 0,2 10-6 5 0,2
Trong thời gian theo dõi, vịt được chăm sóc, nuôi dưỡng tốt trong cùng một điều kiện nhất định. Tiến hành quan sát và theo dõi vịt ở các nghiệm thức trong vòng 7 ngày. Ghi nhận kết quả.
Cách tính liều LD50: tính liều LD50 dựa vào phương pháp Biometry của Reed & Muench (1938).
Cách tính LD50: LgLD50 = LgLD<50 + dp x lgf Trong đó: dp: khoảng cách tỷ lệ. L<50%: phần trăm tử số chết dưới 50%. L>50%: phần trăm tử số chết trên 50%. lgf: Lg10 = 1 50 – L<50% L>50% – L<50% L>50% L>50% – L<50%) 0% L>50% – L<50%) 0% – L<50%) Dp =
23
3.3.2.2 Khảo sát độ an toàn của rChIFN-α và rChIFN-γ ở liều 100µg/con vịt
Chuẩn bị vịt con: sử dụng vịt con từ đàn bố mẹ khỏe mạnh chưa tiêm
phòng bệnh viêm gan vịt type 1 và không chứa kháng thể virus viêm gan vịt type 1.
Huyễn dịch sử dụng: dịch rChIFN-α và rChIFN-γvới liều 100µg/con.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên làm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 5 vịt con. Trong đó ở nghiệm thức thứ nhất, các vịt con sẽ được nhỏ mắt và nhỏ mũi rChIFN-α 100µg/0,1ml/con. Ở nghiệm thức thứ hai các vịt con sẽ được nhỏ mắt, nhỏ mũi rChIFN-γ 100µg/0,1ml/con. Nhóm đối chứng chỉ cho vịt uống 0,1ml PBS. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm đánh giá độ an toàn của rChIFN-α và rChIFN-γ ở liều 100µg/con vịt Nghiệm thức Số vịt thí nghiệm (con) Số lần lặp lại Liều/con Đƣờng cấp rChIFN-α 5 3 100µg Nhỏ mắt và mũi rChIFN-γ 5 3 100µg Nhỏ mắt và mũi PBS 5 3 0,1ml Nhỏ mắt và mũi
Ghi chú: rChIFN: Interferon gà tái tổ hợp.
ĐC PBS: vịt không sử dụng rChIFNs, chỉ cho uống PBS.
Theo dõi vịt thí nghiệm 1 tuần lễ. Ghi nhận tình trạng sức khỏe, tỷ lệ vịt sống, tỷ lệ vịt chết trong các lô thí nghiệm.
Tỷ lệ vịt chết (%) =
3.3.2.3 Khảo sát hoạt tính kháng DHV-1 của rChIFN-α và rChIFN-γ