Sơ đồ tổng quát quy trình thử nghiệm khả năng diệt khuẩn của màng nano TiO2 được thể hiện ở hình 4.14. Để đảm bảo tính chính xác, ban đầu tất cả các mẫu đều được khử trùng bằng cách chiếu đèn tử ngoại trong thời gian 1 giờ để loại bỏ hết vi sinh vật đã có sẵn trên bề mặt.
Hình 4.14. Sơ đồ quy trình nghiên cứu khả năng diệt khuẩn
Để trong bóng tối Cấy VK với nồng độ cho trước
Chiếu sáng tự nhiên
Khử trùng
Các mẫu tổng hợp trên sứ vệ sinh
Lấy VK khỏi bề mặt
Cấy lên các môi trường
114
Chủng vi sinh vật chuẩn được nuôi cấy trong môi trường NA, SA, BA. Môi trường thạch NA, BA thuận lợi cho sự phát triển của hầu hết các loại vi khuẩn, được sử dụng để đánh giá tổng số VSV. Ngoài ra, thạch SA được sử dụng để đánh giá tổng số nấm có trong môi trường pH thấp khống chế hoàn toàn vi khuẩn và chỉ cho phép nấm phát triển. Cách thức chọn và xác định như sau:
-Chọn khuẩn lạc vi sinh vật điển hình để nhuộm soi, xác định tính chất sinh vật hóa học để kiểm tra. Sau đó pha loãng khuẩn lạc với dung dịch nước muối sinh lý 0,85% để đạt nồng độ 106
CFU/ml (sử dụng máy đo độ đục).
-Nhỏ 1,0 ml dịch chứa vi sinh vật nồng độ 106 CFU/ml lên bề mặt mỗi mẫu, dàn đều dịch này khắp bề mặt mẫu. Sau đó các mẫu được chia làm 2 nhóm.
-Sau mỗi thời gian thử nghiệm, các mẫu được lấy ra, dùng thiết bị quét mẫu để rửa trôi số vi sinh vật còn sống sót bám trên bề mặt mẫu. Dung dịch thu được sau khi quét được sử dụng để cấy lên các loại môi trường khác nhau. Nhỏ dung dịch này lên đĩa môi trường và cấy đều trên bề mặt thạch, đặt đĩa trong tủ ấm với nhiệt độ 37 0
C. Sau 24 giờ đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên bề mặt các đĩa thạch, xác định được số lượng vi sinh vật sống sót trên bề mặt mẫu và tỷ lệ VSV bị mất đi tại mỗi thời điểm nghiên cứu so với thời điểm ban đầu theo tiêu chuẩn Việt Nam.
Mỗi điều kiện thí nghiệm được lặp lại trên 3 mẫu và lấy giá trị trung bình.
Hiệu quả khử trùng thực tế của màng phủ nano TiO2 được đánh giá theo tỷ lệ phần trăm (%) và theo công thức:
% 100 ) ( x A B A H Trong đó: H: hiệu suất khử trùng thực tế (%).
A: số lượng VSV trên mẫu không phủ màng được chiếu sáng (M0S). B: số lượng VSV trên mẫu phủ màng được chiếu sáng (M1S hoặc M2S). Trong thí nghiệm này, có 5 loại vi sinh vật được đưa vào thử nghiệm là E.coli, S.aureus, B.subtilis, P.aeruginosa và S.pneumoniae (chủng lấy từ Viện vệ sinh an toàn thực phẩm Quốc gia). Vi khuẩn được cấy lên môi trường thạch NA, BA. Nồng độ vi sinh vật đưa lên gạch được lựa chọn là 106 CFU/ml (số lượng khuẩn lạc được nhân với hệ số 20 vì đã lấy 1/20 thể tích sau khi quét mẫu để cấy và tính ra số lượng vi sinh vật sống sót trên
115
bề mặt mẫu). Mỗi điều kiện thí nghiệm được lặp lại trên 3 mẫu và lấy giá trị trung bình. Khoảng cách chiếu sáng từ nguồn sáng đến mẫu là 30 cm. Thời gian giữa các thời điểm lấy mẫu là 1 giờ, 3 giờ và 6 giờ. Dựa vào kết quả đếm số khuẩn lạc trên các loại thạch, số lượng vi sinh vật trên các mẫu được tính toán cho kết quả cụ thể trong bảng (4.8, 4.9) và đồ thị (4.3, 4.4).
Bảng 4.8 Số lượng vi khuẩn trên các mẫu theo thời gian chiếu sáng
Thời gian (giờ)
Mẫu M0 Mẫu M1 Mẫu M2
M0T M0S M1T M1S M2T M2S 0 1000000 1000000 1000000 1000000 1000000 1000000 1 1000000 948000 1000000 930000 1000000 752000 3 1000000 786000 854000 106000 856000 16000 6 958000 688000 764000 36000 768000 8000 Ta thấy có sự giảm dần số lượng vi khuẩn và tỷ lệ vi khuẩn bị tiêu diệt tăng theo thời gian khảo sát (đồ thị 4.3 và đồ thị 4.4). Các kết quả được tính dựa theo số lượng khuẩn lạc trên thạch NA.
116
Tỷ lệ vi khuẩn bị chết theo thời gian được tính theo công thức: h = (106 - A)*100%/106
Trong đó: h : tỷ lệ vi khuẩn bị chết (%).
A: số vi khuẩn có mặt trên mẫu tại thời điểm nghiên cứu. 106: số vi khuẩn cấy lên mẫu để nghiên cứu.
Bảng 4.9. Tỷ lệ vi khuẩn bị chết trên các mẫu theo thời gian nghiên cứu
Thời gian (giờ)
Mẫu M0 Mẫu M1 Mẫu M2
M0T(%) M0S(%) M1T(%) M1S(%) M2T(%) M2S(%)
0 0 0 0 0 0 0
1 0 5,2 0 7 0 24,8
3 0 21,4 14,6 89,4 14,4 98,4
6 4,2 31,2 23,6 96,4 23,2 99,2
Đồ thị 4.4 Tỷ lệ vi khuẩn bị chết theo thời gian
T ỷ lệ vi k hu ẩn b ị ch ết (%)
117
Mặt khác kết quả trên đồ thị 4.4 cho thấy, ngay tại thời điểm sau 1 giờ thí nghiệm, lượng mẫu vi khuẩn ở mẫu M1-S bị tiêu diệt lớn không đáng kể so với mẫu M0-S, tỷ lệ tương ứng là 5,2% và 7%. Lượng mẫu vi khuẩn bị tiêu diệt ở mẫu M2-S có tỷ lệ 24,8% gấp 3,5 lần so với mẫu M1-S và gần 5 lần so với mẫu và M0-S. Nhưng sau 3 giờ chiếu sáng, tỷ lệ vi khuẩn chết ở mẫu M1-S là 89,4% và mẫu M2-S gần như tuyệt đối là 98,4%. Còn mẫu M0-S chỉ tiêu diệt được 21,4%. Sau 6 giờ chiếu sáng, số lượng vi khuẩn trên các mẫu M1-S và M2-S chết gần như hoàn toàn tương ứng với tỷ lệ 96,4% và 99,2%. Như vậy, hầu hết số vi khuẩn sau thời gian chiếu sáng từ 3 đến 6 giờ đã bị tiêu diệt hoàn toàn.
So sánh các mẫu để trong bóng tối, sau 1 giờ chưa có con vi khuẩn nào bị tiêu diệt. Sau 3 giờ lượng vi khuẩn trong mẫu M1-T và M2-T bị tiêu diệt là rất ít khoảng 14,6% đến 14,6% và sau thời gian 6 giờ tăng lên 23,2% đến 23,6%. Nguyên nhân của sự suy giảm này có thể do quá trình chết tự nhiên. Thực nghiệm nghiên cứu khả năng diệt khuẩn của vật liệu trên các đĩa thạch dinh dưỡng sau khi cấy và để trong tủ ấm ở 370C trong vòng 24 giờ.