I CAM OAN
3. 1B trí thí ngh im xác nh chs ELD5 0a IBDV trên phôi gà
pha loãng virus S l ng phôi c tiêm Li u tiêm (ml/phôi)
10-1 5 0,2 ml 10-2 5 0,2 ml 10-3 5 0,2 ml 10-4 5 0,2 ml 10-5 5 0,2 ml 10-6 5 0,2 ml 10-7 5 0,2 ml 10-8 5 0,2 ml
Ghi nh n t l phôi ch t sau 3-5 ngày sau khi gây nhi m virus. n ngày th 5 sau khi gây nhi m m toàn b phôi tính li u gây ch t trên phôi.
Cách tính li u ELD50:
Công th c tính ELD50trên phôi gà nh vào ph ng pháp Biometry c a Reed và Muench (1938). lgELD50= lgELD <50 + dp x lg f Trong ó: 50 - L <50% dp = L>50% - L <50 % dp: kho ng cách t l L>50%: ph n tr m s phôi ch t trên 50% L <50%: ph n tr m s phôi ch t d i 50% lg f: lg10 =1
3.3.3 Xác nh c l c c a virus Gumboro trên gà 3 tu n tu i
M c tiêu: ánh giá c l c c a virus Gumboro trên gà 3 tu n tu i.
B trí thí nghi m: gà 3 tu n tu i c b trí ng u nhiên thành 2 nghi m th c,
nghi m th c i ch ng không tiêm truy n virus ch cho u ng 0,2ml PBS và nghi m th c còn l i c gây nhi m v i 0,2ml d ch virus Gumboro qua ng u ng, m i nghi m th c v i s gà là 30 con. Theo dõi t l gà s ng, ch t ánh giá c l c c a virus Gumboro. Tr c khi ti n hành thí nghi m, chúng tôi ti n hành l y huy t thanh gà thí ngh m ki m tra kháng th th ng kháng virus Gumboro b ng ph n ng ELISA, nh ng gà c dùng thí nghi m ph i có k t qu âm tính.
B ng 3.2 B trí thí nghi m kh o sát c l c c a virus Gumboro trên gà 3 tu n tu i Nghi m th c S gà TN Li u/con ng c p C(PBS) 30 0,2ml ng Virus 30 0,2ml ng C: i ch ng TN: Thí nhi m
3.3.4 ánh giá hi u qu phòng và u tr b nh Gumboro c a rChIFN- và
rChIFN- trên gà 3 tu n tu i
Thí nghi m 1:
c tiêu: xác nh hi u qu c a rChIFN- và rChIFN- trong vi c phòng b nh
Gumboro trên gà 3 tu n tu i
B trí thí nghi m: gà 3 tu n tu i (không có kháng th Gumboro) c b trí ng u
nhiên thành 4 nghi m th c, m i nghi m th c 30 con. Nghi m th c i ch ng âm gà không c gây nhi m v i virus Gumboro, nghi m th c i ch ng d ng gà c gây nhi m v i 0,2ml d ch virus Gumboro (105ELD50) và không c u tr . 2 nghi m th c phòng b nh v i li u 100µg rChIFN- + 1µg rChIFN- và 10µg rChIFN- + 1µg rChIFN- . 2 nghi m th c phòng b nh gà c cho s d ng d ch rChIFN- + rChIFN- m i ngày, dùng liên t c 3 ngày, sau ó 24 gi gây nhi m v i virus Gumboro. Ghi nh n t l gà b nh, t l gà ch t và tr ng l ng gà các nghi m th c.
ng 3.3 B trí thí nghi m ánh giá hi u qu phòng b nh Gumboro c a rChIFN- và rChIFN- trên gà 3 tu n tu i Nghi m th c l ng (con) Li u/con ng c p ngày c p (1 ngày 1 l n) 100µg rChIFN- + 1µg rChIFN- 30 100µg + 1µg Nh m t, m i 3 10µg rChIFN- + 1µg rChIFN- 30 10µg + 1µg Nh m t, m i 3 C (-) 30 0,2ml PBS U ng 1 C (+) 30 0,2ml virus U ng 1
rChIFN: interferon gà tái t h p
Thí nghi m 2:
c tiêu: xác nh hi u qu c a rChIFN- và rChIFN- trong vi c u tr b nh
Gumboro trên gà 3 tu n tu i
B trí thí nghi m: gà 3 tu n tu i (không có kháng th Gumboro) c b trí ng u
nhiên thành 3 nghi m th c, m i nghi m th c 30 con. Nghi m th c i ch ng âm gà không c gây nhi m v i virus Gumboro, nghi m th c i ch ng d ng gà c gây nhi m v i 0,2ml d ch virus Gumboro (105ELD50) và không c u tr . Nghi m th c tr b nh v i li u 100µg rChIFN- và 1µg rChIFN- . Sau khi gây nhi m v i virus
Gumboro 8 gi gà c u tr v i d ch rChIFN- + rChIFN- và ti p t c dùng liên ti p 5 ngày. Ghi nh n t l gà b nh, t l gà ch t và tr ng l ng gà các nghi m th c.
ng 3.4 B trí thí nghi m ánh giá hi u qu u tr b nh Gumboro c a rChIFN- và rChIFN- trên gà 3 tu n tu i Nghi m th c l ng (con) Li u/con ng c p ngày c p (1 ngày 1 l n) 100µg rChIFN- + 1µg rChIFN- 30 100µg + 1µg Nh m t, m i 5 C (-) 30 0,2ml PBS U ng 1 C (+) 30 0,2ml virus U ng 1
rChIFN: interferon gà tái t h p
Trong th i gian th nghi m, gà c ch m sóc, nuôi d ng trong cùng u ki n nh nhau. Trong su t quá trình thí nghi m, theo dõi bi u hi n c a gà sau khi gây nhi m, ghi nh n s gà b nh, s gà ch t và cân tr ng l ng gà t ng thí nghi m. Ti n hành m khám nh ng gà ch t, ghi nh n b nh tích và thu l y m u b nh ph m (túi Fabricius, tuy n c, lách, gan) ki m tra virus Gumboro qua ph n ng AGP. Nh ng gà còn s ng thì l y huy t thanh và ki m tra kháng th kháng virus Gumboro b ng ph n
ng ELISA.
3.4 Ph ng pháp xét nghi m
3.4.1 Ph ng pháp ki m tra virus Gumboro b ng ph n ng k t t a khu ch tán trênth ch (Agar gel precipitation, AGP) th ch (Agar gel precipitation, AGP)
Nguyên lý: k t h p c hi u gi a kháng nguyên hòa tan và kháng th t ng
ng s hình thành ph c h p kháng nguyên - kháng th . Ph c h p kháng nguyên - kháng th t n m t m c nh t nh thì có s bão hòa, lúc này s x y ra hi n
ng k t t a.
N u thi u 1 trong 2 thành ph n này thì s k t t a không x y ra. S k t t a bi u hi n b ng ch t c n màu tr ng xám trông r t rõ r t. S k t h p này òi h i u ki n nhi t , pH thích h p và môi tr ng có ch t n gi i.
Chu n b th ch
Hòa tan 1,6g agarose vào 100ml n c sinh lý 0,85%, un cho th ch tan. Sau ó, th ch lên lame m t l p dày kho ng 3mm gi lame nhi t 4 - 100C/10 phút cho th ch ông l i.
Dùng d ng c c th ch b ng kim lo i có ng kính 3mm, c m i l 7 c m, t l gi a và 6 l xung quanh, m t lame c 2 c m.
Ti n hành
L gi a m i c m cho kháng th chu n (xét nghi m ch n oán kháng nguyên), các l xung quanh b trí theo chi u kim ng h , 1 l v trí 12 gi cho kháng nguyên chu n (huy n d ch virus Gumboro) làm i ch ng d ng, 1 l cho kháng nguyên âm tính làm i ch ng âm, 4 l còn l i cho huy n d ch c n ch n oán. Sau ó cho vào
m 370C t 6-24 gi , em ra c k t qu .
c k t qu
N u th y gi a kháng th và huy n d ch c n ch n oán xu t hi n v ch k t t a gi ng nh kháng th chu n và kháng nguyên chu n thì k t lu n ph n ng d ng tính. Ng c l i n u gi a kháng th và huy n d ch c n ch n oán không xu t hi n v ch k t
a thì ph n ng âm tính.
Ng c l i ch n oán m u huy t thanh c a gà có kháng th kháng virus Gumboro, có th làm ph n ng ng c l i b ng cách cho kháng nguyên chu n vào l chính gi a, 1 l v trí 12 gi cho kháng th chu n (kháng th kháng virus Gumboro) làm i ch ng d ng, 1 l kháng th âm tính làm i ch ng âm, các l còn l i cho huy t thanh c n ki m tra. N u th y gi a kháng nguyên chu n và huy t thanh c n ch n oán xu t hi n v ch k t t a màu tr ng gi ng nh gi a kháng nguyên chu n và kháng th chu n thì k t lu n ph n ng d ng tính. Ng c l i, gi a các l huy t thanh c n ch n oán và kháng nguyên c n ch n oán không xu t hi n v ch k t t a nào thì k t lu n ph n ng âm tính.
Hình 3.1 M u th ch dùng làm ph n ng AGP
3.4.2 Ph ng pháp ki m tra kháng th kháng virus Gumboro b ng ph n ngELISA (Enzyme linked ìmmuno sorbent assay) ELISA (Enzyme linked ìmmuno sorbent assay)
Nguyên lý: thu t ELISA là ph n ng huy t thanh h c d a vào ph n ng mi n
ch h c gi a kháng nguyên và kháng th chu n. Kháng nguyên ho c kháng th trong u huy t thanh d ng tính s c g n k t v i kháng nguyên ho c kháng th ã c g n s n trong gi ng. Thành ph n không g n k t s b r a trôi, ph n gi l i ti p c k t h p v i Conjugate (ch t k t h p) có enzyme peroxidase. Ph n ng chuy n màu (t màu xanh lá cây sang màu xanh d ng) khi có s tham gia c a c ch t
i m u xét nghi m. Máy c b c sóng phù h p s xác nh l ng kháng th ho c kháng nguyên b gi l i trong gi ng.
Chu n b m u
Các m u c n ki m tra c pha loãng 500 l n (1µl m u v i 500 µl dung d ch pha u, i kèm b kit).
Các b c th c hi n
T t c các thành ph n c a b kit c n nh nhi t phòng (20 – 27oC), c u các l tr c khi s d ng.
1. L y a 96 gi ng ã c ph kháng nguyên ( a kèm theo trong b kit) 2. Cho 100µl d ch i ch ng âm không pha loãng vào gi ng A1, A2
3. Cho 100µl d ch i ch ng d ng không pha loãng vào gi ng A3, A4
4. Cho 100µl d ch m u ã pha loãng vào các gi ng t ng ng v i th t m u trên a
5. a nhi t phòng 30 phút
6. Hút b t t c các d ch n i trong các gi ng b vào b n r a d ng c
7. R a toàn b các gi ng, s d ng kho ng 350µl n c c t ho c n c kh ion a m i gi ng, vi c r a này ti n hành 3-5 l n.
8. Cho 100µl dung d ch Conjugate vào m i gi ng 9. a nhi t phòng 30 phút
10. L p l i b c 6, 7
11. Cho 100µl dung d ch TMB substrate vào m i gi ng 12. a nhi t phòng 15 phút
13. Cho 100µl dung d ch Stop solution vào m i gi ng d ng ph n ng 14. o s h p ph ánh sáng b c sóng 650nm.
ng 3.5 B trí thí nghi m m u huy t thanh trong xét nghi m ELISA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12