I CAM OAN
2. 3B nh Gumboro
3.4.2 Ph ng pháp kim tra kháng th kháng virus Gumbor ob ng
ELISA (Enzyme linked ìmmuno sorbent assay)
Nguyên lý: thu t ELISA là ph n ng huy t thanh h c d a vào ph n ng mi n
ch h c gi a kháng nguyên và kháng th chu n. Kháng nguyên ho c kháng th trong u huy t thanh d ng tính s c g n k t v i kháng nguyên ho c kháng th ã c g n s n trong gi ng. Thành ph n không g n k t s b r a trôi, ph n gi l i ti p c k t h p v i Conjugate (ch t k t h p) có enzyme peroxidase. Ph n ng chuy n màu (t màu xanh lá cây sang màu xanh d ng) khi có s tham gia c a c ch t
i m u xét nghi m. Máy c b c sóng phù h p s xác nh l ng kháng th ho c kháng nguyên b gi l i trong gi ng.
Chu n b m u
Các m u c n ki m tra c pha loãng 500 l n (1µl m u v i 500 µl dung d ch pha u, i kèm b kit).
Các b c th c hi n
T t c các thành ph n c a b kit c n nh nhi t phòng (20 – 27oC), c u các l tr c khi s d ng.
1. L y a 96 gi ng ã c ph kháng nguyên ( a kèm theo trong b kit) 2. Cho 100µl d ch i ch ng âm không pha loãng vào gi ng A1, A2
3. Cho 100µl d ch i ch ng d ng không pha loãng vào gi ng A3, A4
4. Cho 100µl d ch m u ã pha loãng vào các gi ng t ng ng v i th t m u trên a
5. a nhi t phòng 30 phút
6. Hút b t t c các d ch n i trong các gi ng b vào b n r a d ng c
7. R a toàn b các gi ng, s d ng kho ng 350µl n c c t ho c n c kh ion a m i gi ng, vi c r a này ti n hành 3-5 l n.
8. Cho 100µl dung d ch Conjugate vào m i gi ng 9. a nhi t phòng 30 phút
10. L p l i b c 6, 7
11. Cho 100µl dung d ch TMB substrate vào m i gi ng 12. a nhi t phòng 15 phút
13. Cho 100µl dung d ch Stop solution vào m i gi ng d ng ph n ng 14. o s h p ph ánh sáng b c sóng 650nm.
ng 3.5 B trí thí nghi m m u huy t thanh trong xét nghi m ELISA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A − − + + M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 B M9 M10 M11 M12 M13 M14 C D E F G H M88 M89 M90 M91 M92 (-): i ch ng âm (+): i ch ng d ng
M1, M2, M3, M92: m u huy t thanh c n ch n oán
Tính toán k t qu
Xét nghi m có giá tr khi, s khác bi t gi a trung bình i ch ng d ng và trung bình i ch ng âm (PCx – NCx) l n h n 0,075. M c h p th trung bình c a i ch ng âm ph i nh h n ho c b ng 0,150. S hi n di n ho c v ng m t c a kháng th kháng Gumboro trong m u huy t thanh c xác nh d a vào các giá tr OD o c
b c sóng 650nm khi so sánh các m u th nghi m v i giá tr trung bình c a i ch ng d ng. S t ng quan n ng kháng th trong các m u th nghi m c xác
nh b ng cách tính toán t s S/P.
Tính toán k t qu
Trong ó :
NCx là giá tr trung bình i ch ng âm. PCx là giá tr trung bình i ch ng d ng.
S/P là t l d ng tính c a m u
i t ng quan gi a hi u giá và ch s S/P pha loãng 1:500 v i hi u giá cu i log10 hi u giá = 1,09(log10 S/P ) + 3,36 Giá tr OD650gi ng A1 + Giá tr OD650gi ng A2 NCx = 2 Giá tr OD650gi ng A3 + Giá tr OD650gi ng A4 PC x = 2 Giá tr OD650trung bình m u - NCx S/P = PCx - NCx
Gi i thích k t qu
s S/P trong các m u huy t thanh th p h n ho c b ng 0,2 t ng ng v i k t qu âm tính. T s S/P l n h n 0,2 có ngh a là k t qu d ng tính và cho th y gà ã c tiêm ng a ho c ã ti p xúc v i virus Gumboro. Hi u giá kháng th 396 thì m u huy t thanh d ng tính v i kháng th kháng virus Gumboro.