I CAM OAN
2. 3B nh Gumboro
2.5.1 Trong nc
Cho n nay ch a có nhi u nghiên c u trong n c v tác d ng kháng virus in vitro c a ChIFN- i v i các virus gây b nh trên gia c m.
N m 2000, Vi t Nam ph i h p v i các nhà khoa h c Ucraina ã s n xu t th thành công IFN – t i vi n vaccine Nha Trang theo công ngh dùng phage c aE. Coli
làm vect , do ó vi c chi t IFN d dàng h n (Ph m V n Ty, 2005).
N m 2003, vi n vaccine Nha Trang c ng b t u nghiên c u s n xu t thu c nh i làm t IFN phòng ch ng b nh cúm và các b nh ng hô h p do virus gây ra (Tuy t Qu nh, 2004).
N m 2010, Nguy n Ng c n et al. ã th ho t tính kháng virus in vitro a rChIFN-α trên v bào t Bacillus subtilis. K t qu th nghi m cho th y rChIFN- có kh n ng kháng IBDV và NDV tùy thu c vào li u. Ho t tính kháng virus th hi n s
2.5.2 Ngoài n c
N m 1976, công trình u tiên u tr viêm gan B mãn tính b ng IFN c a Greenberg và ctv. Các tác gi ã dùng IFN c a t bào b ch c u do Kari Cantell Ph n Lan cung c p u tr cho 4 b nh nhân viêm gan B v i k t qu kh quan (trích d n Bùi i, 2002)
N m 1980, Walterr Gillbert và Charles Wiesmann nghiên c u thành công s n xu t IFN ng i b ng con ng tái t h p trong t bào E. Coli (Nguy n Khu t Thanh, 2006).
T i Hungary, ng i ta ã dùng IFN u tr các b nh nhi m virus và b nh ung u ng i. n n m 1987, Hoofnagle ã thành công trong vi c dùng IFN u tr viêm gan C, m ra kh n ng ng d ng r ng rãi trong u tr các b nh nhi m virus và ung th trên ph m vi th gi i (Tuy t Qu nh, 2004).
N m 1982, Trung Qu c s n xu t IFN b ng ph ng pháp công ngh sinh h c (Ph m V n Ty, 2005).
N m 2001, Mo et al. ã kh o sát tác ng in vitro và in vivo c a rChIFN- i i IBDV và NDV. Trong nghiên c u này, rChIFN- cDNA c t ng h p b ng ph ng pháp RT-PCR, sau ó s n ph m c bi u hi n trên h th ng t bào E. coli. ki m tra tác ng kháng virus c a IFN tái t h p, hai th nghi m c ti n hành: (i) t bào CEF c v i 3 hàm l ng rChIFN- (0, 100, 300 g/gi ng) trong 15 gi tr c khi thêm vào 33 PFU (plaque forming unit) IBDV, (ii) gi l ng c nh ChIFN- (350 g/gi ng), các pha loãng IBDV theo b c 10 thêm vào sau 15 gi . t qu ghi nh n rChIFN- có tác ng ng n c n s hình thành ho i t t bào do IBDV theo ph ng th c ph thu c li u c p, s l ng ho i t gi m i khi t ng hàm
ng rChIFN- .
M t nghiên c u khác trong n m 2001, Pei et al. mô t ho t tính kháng virus gây nh viêm ph qu n truy n nhi m (IBV) trong u ki nin vitro vàin vivo c a ChIFN- tách t t bào lách gà t nhiên và rChIFN- type I. C 2 lo i interferon u ng n c n s nhân lên c a IBV ch ng Beaudette trên t bào th n gà (CKC – chicken kidney cell) theo ph ng th c ph thu c li u c p. B ng cách quan sát s thành l p c a h p bào, th y r ng IFN li u 100 IU/ml ã làm gi m 50% s nhân lên c a virus.
Nh ng n m sau ó, nhi u nghiên c u in vitro v rChIFN- c th c hi n. Trong ó, các k t qu cho th y ho t tính kháng virus c a rChIFN- nh ng n c n s sao chép c a virus gây b nh Marek c l c cao (vvMDV – very virulent Marek’s disease virus) (ch ng RB-1B) (Jarosinski et al., 2001), virus cúm H9N2 (Wei et al.,
2006) trên t bào CEF.
M t b c ti n m i vào n m 2008, Songet al. nghiên c u t o rChIFN- bi u hi n trong rau di p (Lactuca sativa L.). S n ph m ban u cho th y tính kh quan trong
mi ng có m n n c (VSV) trên t bào CEF. Sau khi x lý v i protein chuy n gene, CEFs c gây nhi m virus v i 100 TCID50. K t qu cho th y rChIFN- có kh n ng m ng ho t tính kháng virus c a t bào. M t n m sau ó, Song et al. ti p t c bi u hi n rChIFN- trong cây thu c lá (Nicotiana tabacum), ho t tính sinh h c c a protein thu c là 5,01.103 IU/g mô. Tuy nhiên, nhóm tác gi ngh c n có nh ng nghiên
u xa h n v rChIFN- trong cây th c n ch n nuôi chuy n gene.
Khi ki m tra vai trò c a ChIFN- và t bào CEF khác nhau v geneMx631trong vi c kháng IBDV, O'Neill et al. (2010) ã ch ng minh ChIFN- có ho t tính kháng virus m nh trong vi c làm gi m hi u giá virus, không ph thu c vào ki u gene Mx,
cho th yMx631không ph i là y u t quy t nh kháng IBDV trên t bào CEF.
Cùng n m 2010, Kuri et al. ã gây nhi m virus gây s t thung l ng Rift (RVFV – Rift valley fever virus) trên t bào CEF và ki m tra ho t tính kháng virus này c a rChIFNs, c bi u hi n và tinh s ch trên h th ng E. coli. Trong th nghi m, 104 bào nuôi c y ban u c qua êm 5% CO2 và 37°C, sau ó x lý tr c 7 gi v i các n ng rChIFNs khác nhau tr c khi gây nhi m virus. K t qu rChIFNs c ch
nhân lên c a virus theo ph ng th c ph thu c li u th nghi m t 1 n 25 IU/ml. Trong m t nghiên c u m i ây, Jianget al.(2011) ã so sánh kh n ng b o v t bào c a rChIFN- trên t bào ph i s c p c a gà, v t và gà tây tr c khi gây nhi m v i virus H1N1 (A/turkey/Virginia/SEP-4/2009) và virus H5N9 (A/turkey/Wisconsin/1968). i vi c x lý tr c v i 1.000 IU/ml rChIFN- trong 18 gi , rChIFN- ã làm gi m áng s nhân lên c a virus trong 2 lo i t bào ph i s c p c a gà và gà tây, m c gi m ít n t bào ph i v t. C th , s t ng sinh c a virus gi m x p x 200 l n trên t bào gà và gà tây, kho ng 30 l n trên t bào v t sau 48 gi gây nhi m. Các s li u này ch ng t r ng rChIFN- có th làm gi m s nhân lên c a virus và có ho t tính sinh h c trên các loài gia
m khác.
Tuy nhiên, khi ánh giá ho t tính kháng virus c a rChIFN- và m i liên h v i NS1 (nonstructural protein 1 – protein c cho là ng n c n s t ng h p IFN) c a virus, Penski et al. (2011) cho r ng c rChIFN- và IFN do virus c m ng ch a th hi n y kh n ng b o v t bào kháng l i virus cúm gây b nh cao, trong nghiên
u này là 2 subtypes H5N1 và H7N7.
Bên c nh ó, nhóm nghiên c u c ng nh n m nh NS1 c a virus không óng vai trò chính trong vi c ng n c n s t ng h p IFN su t giai n nhi m gà.
B ng vi c s d ng k thu t mi n d ch hu nh quang gián ti p và RT-PCR, Houel al. (2011) ã ánh giá tác ng kháng NDV và VSV c a rChIFN- c bi u hi n trên th ng P. pastoris. K t qu cho th y các t bào CEF c x lý v i rChIFN- ít nhi m virus h n so v i i ch ng không x lý rChIFN- .
H n n a, tác ng kháng virus t l v i n ng rChIFN- th nghi m, v i n ng 1.000 IU/ml cho hi u qu c ch sao chép virus cao h n 100 IU/ml, cao nh t
20.000 IU/ml, nh ng n 50.000 IU/ml rChIFN- ã th hi n tính c nh t bào co tròn, tách kh i b m t nuôi c y.
Ch ng 3
I DUNG VÀ PH NG PHÁP THÍ NGHI M
3.1 N i dung thí nghi m
Chu n và xác nh c l c c a virus Gumboro trên phôi gà b ng ph ng pháp xác nh li u gây ch t 50% phôi (ELD50 - Embryo lethal dose 50%).
Kh o sát c l c c a virus Gumboro trên gà 3 tu n tu i.
Xác nh hi u qu phòng và u tr b nh Gumboro c a d ch rChIFN- và rChIFN- trên gà 3 tu n tu i.
3.2 Ph ng ti n thí nghi m
3.2.1 Th i gian và a m th c hi n tài:
Th i gian: t tháng 08/2013 n tháng 12/2013.
a m: Tr i ch n nuôi th c nghi m và phòng thí nghi m virus h c, B Môn Thú Y, Khoa Nông Nghi p và Sinh h c ng d ng, tr ng i h c C n Th .
3.2.2 V t li u thí nghi m i t ng thí nghi m
Tr ng gà có phôi ( p 10 ngày), tr ng c mua t gà nuôi th v n, kh e m nh, không tiêm vaccine phòng b nh Gumboro (ngu n: mua t h gia ình t i qu n Cái
ng, thành ph C n Th ). S l ng 40 tr ng có phôi.
Gà 3 tu n tu i là gi ng gà lai gi a gà L ng Ph ng, Tam Hoàng và gà công nghi p, không b nhi m virus và không ch a kháng th kháng virus Gumboro, s
ng gà thí nghi m là 222 con (ngu n: mua t m t tr i gà gi ng t nh V nh Long). D ch rChIFN- và rChIFN- (Trung tâm công ngh sinh h c Thành ph H Chí Minh). Hàm l ng protein thô 900µg/ml
Kháng th kháng virus Gumboro, virus Gumboro (ngu n: Navetco)
D ng c và thi t b
Máy p tr ng, t c y vô trùng, máy ly tâm l nh, t s y, ng tiêm y t , ng nghi m vô trùng, g ng tay, kh u trang, giá ng ng nghi m, bông gòn, bình tr l nh, type ng huy t thanh, micropipet, ng falcon, chày c i, dao m , kéo, èn c n, a petri, d ng c c l th ch, lam, parafilm...
Hóa ch t và sinh ph m
Dung d ch PBS, kháng sinh (penicillin 1000UI/ml, streptomycin 1000µg/ml), dung d ch n c mu i sinh lý 0,85%, c n 700, n c c t, agarose, ELISA kit.
Huy t thanh gà
Vaccine phòng b nh u gà, b nh cúm gia c m, b nh Newcatle, b nh t huy t trùng.
3.3 Ph ng pháp thí nghi m
3.3.1 Ph ng pháp chu n b huy n d ch b nh ph m
M c tiêu: o c huy n d ch b nh ph m ch a virus gây b nh Gumboro s
ng cho các thí nghi m sau.
Quá trình gây nhi m cho gà: nuôi 12 gà t 5 ngày tu i n 3 tu n tu i (không
ch ng ng a vaccine Gumboro). Gà c cho u ng 0,2 ml d ch virus Gumboro (ngu n Navetco). H ng ngày theo dõi bi u hi n b nh c a gà sau khi gây nhi m. Khi gà xu t hi n nh ng tri u ch ng c tr ng c a b nh Gumboro nh gi m n, tiêu ch y phân tr ng, xù lông, rúc u vào cánh,...ti n hành m và thu m u b nh ph m: túi Fabricius, lách, gan, tuy n c.
Chu n b huy n d ch b nh ph m: các m u b nh ph m nh túi Fabricius, lách,
gan, tuy n c c c t nh nghi n trong c i s sau ó pha v i n c sinh lý có kháng sinh penicillin (1000UI/ml) và streptomycin (1000µg/ml) v i t l 1:1, cho vào tube nh a 10ml. em ly tâm nhi t 40C, trong 15 phút v i v n t c 4.000 vòng/phút. Thu d ch n i và b c n, d ch n i ti p t c c ly tâm l n 2 nhi t 40C, trong 15 phút v i v n t c 4.000 vòng/phút. B o qu n huy n d ch -800C gây nhi m trên phôi.