nội công sinh trong cây dược liệu
2.3.1.1.Phương pháp thu thập và xử lý mẫu
Những cây thuốc mọc hoang dại trong tự nhiên khỏe mạnh, sinh trưởng tốt, không có biểu hiện bệnh lý được lựa chọn. Toàn bộ cây được thu, và rửa sạch đất bám ở rễ, thân, lá, cuống, hoa. Sau đó cắt rời rễ, thân, lá, cuống, hoa, quả… thành từng đoạn nhỏ.
Để loại trừ các vi sinh vật còn bám ở trên bề mặt, mẫu sau khi thu thập được tiến hành xử lý như sau: các lá già được loại bỏ, các phần rễ, thân, lá và hoa được rửa sạch dưới vòi nước mạnh, sau đó được rửa lại bằng nước cất vô trùng (2 lần) và được cắt thành những đoạn nhỏ 1 – 2 cm sử dụng kéo vô trùng. Các đoạn mẫu này được khử trùng bề mặt trong cồn 75% trong 10 phút, trong nước javen 2% trong 7 phút và được rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng.
Để kiểm tra khả năng các vi sinh vật còn sót lại trên bề mặt mẫu sau khi khử trùng, 100 µl nước rửa mẫu lần cuối được trang đều lên các đĩa môi trường Trypton – Yeast Extract – Glucose – Agar [35], và ủ ở 300C. Nếu sau 48 giờ ủ, các đĩa môi trường này không có sự xuất hiện các khuẩn lạc thì mẫu đã khử trùng đạt yêu cầu.
PHIẾU THU MẪU THỰC VẬT Địa điểm thu mẫu:
Thời gian thu: Stt Tên loài Bộ phận Ký hiệu mẫu Ghi chú Rễ 1A Thân 1B 1 Ngải cứu Artemisia vulgaris L. Lá 1C Rễ 2A Thân 2B
2 Thanh hao hoa vàng
Artemisia annua L. Lá 2C Rễ 3A Lá 3C 3 Mã đề Plantago asiatic L. Hoa 3D Rễ 4A Thân 4B Lá 4C 4 Rau dệu Alternanthera sessilis (L.) A. DC. Hoa 4D Rễ 5A Thân 5B Lá 5C 5 Kim tiền thảo
Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.
Hoa 5D
2.3.1.2.Phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh một số cây thuốc
5g mẫu đã được khử trùng bề mặt được nghiền nát trong cối sứ chứa 45 ml nước muối sinh lý. Dịch nghiền (100 µl) của mẫu được trang đều trên các
môi trường khác nhau: S Agar (Lechevalier, 1983) [22], Starch – Casein Agar (Kuster, 1964) [21], và Four Yeast – Extract Sucrose Caein Hydrolysate Agar [27], [28], có bổ sung thêm 30 mg nalidixic acid, 20 mg ketconazole và 50 mg cyloheximide để ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn và nấm. Các đĩa sau khi trang được ủ ở 280C đến 4 tuần. Các khuẩn lạc xạ khuẩn sẽ được phân lập và được cấy chuyển sang các đĩa môi trường Gause II để tách dòng.
Các chủng xạ khuẩn được giữ trong môi trường Gause II trong ống nghiệm. Những chủng này được bảo quản trong Glycerol 15% ở - 800C.
2.3.1.3. Cấy truyền và giữ giống
Mục đích của việc cấy truyền và giữ giống là để bảo quản giống tránh hiện tượng thoái hóa giống. Các chủng xạ khuẩn đã lựa chọn được cấy trên môi trường thạch nghiêng Gause II ở nhiệt độ phòng. Sau 10 - 14 ngày khi xạ khuẩn mọc tốt, các ống giống được bảo quản trong tủ lạnh ở 4 - 60C. Sau 2 - 3 tháng cấy truyền lại một lần.
Để bảo quản lâu giống được giữ trong ống cát, trong parafin lỏng vô trùng giữ lạnh sâu trong glycerol hoặc đông khô, bảo quản được 6 tháng đến 2 năm.