2 .3.3.3 Vi khuẩn Azospirillum
3.2.2.2. Xác định khả năng tổng hợp NH4+
a.Nguyên tắc
Xác định nồng độ NH4+ nhờ phản ứng phenol và NH3 với sự hiện diện của tác nhân oxy hóa là hypochlorite hình thành có phức màu xanh, dưới pH kiềm. Sự hiện diện của sodium nitroprusside làm tăng hiệu quả của phản ứng giữa NH3 với phenol và lên khoảng 10 lần (Page et al., 1982)
b.Hóa chất:
- Chuẩn bị dung dịch KCl2 M: Hòa tan 15 g KCl vào trong 100 ml nước cất. - Stock (NH4+): Hòa tan 0,4717g (NH4)2SO4 vào 1 lít nước. Trữ dung dịch trong
tủ lạnh. Trước khi sử dụng pha loãng 4ml stock (NH4+) với 196 ml dung dịch KCl 2M đểđược 200ml, sau cùng được dung dịch 2µg/ml.
- Thuốc thử phenol nitroprusside: hòa tan 5g phenol và 0,025g nitroprusside trong nước được 0,5L.
- Hypochloride buffer: hòa tan 15ml NaOCl + 5g NaOH vào nước được 0,5L. - Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường NFb lỏng
c.Tiến hành thí nghiệm:
- Cho 15ml môi trường lỏng NFb, New và Burk vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ướt 121oC trong 20 phút.
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần. - Nuôi cấy các dòng vi khuẩn trên máy lắc 200 vòng/phút.
* Định lượng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng) d.Phương pháp định lượng:
+ Chuẩn bị thuốc thử phenol nitroprusside: cân chính xác 5g phenol và 0,025g nitroprusside hòa tan thêm nước cất vào đến 0,5L.
+ Pha buffer: cho 1ml NaOCl có nồng độ (5 – 5,25 %) và 5 g NaOH vào 0,5L nước cất.
Hình 4: Sự thay đổi màu của dãy dung dịch NH4+ theo phương pháp Indophenol Blue
( *Ghi chú từ trái sang phải của hình là 0,1, 2, 3, 4 và5µg/ml)
(Hình chụp ngày 2/10/2014)
• Đường chuẩn 0 ppm gồm có: 5ml H2O: 0ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử
• Đường chuẩn 1 ppm gồm có: 4ml H2O: 1ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử
• Đường chuẩn 2 ppm gồm có: 3ml H2O: 2ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử
• Đường chuẩn 3 ppm gồm có: 2ml H2O: 3ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử
• Đường chuẩn 4 ppm gồm có: 1ml H2O: 4ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử
• Đường chuẩn 5 ppm gồm có: 0ml H2O: 5ml NH4+, 5ml buffer, 5 ml thuốc thử
+ Đo nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn
• Hút 1,5ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf. • Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
• Hút 1ml dịch vi khuẩn đã ly tâm và 4ml H2O, 5ml buffer, 5ml thuốc thử. Tiến hành đo phổ OD.
• Dựa vào sự thay đổi màu của phản ứng giữa thuốc thử và NH4+, đo OD ở