2 .3.3.3 Vi khuẩn Azospirillum
4.5.1. Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn gây bện hở đường ruột E.Coli
Khi khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng VKNS phân lập được với vi khuẩn E. coli gây bệnh đường ruột, dòng KR2, KR3, KT3, KL2B, KL, KT1 có khả
năng tạo vòng sáng. Điều này chứng tỏ các dòng có khả năng KR2, KR3, KT3, KL2B, KL, KT1 kháng lại vi khuẩn E. coli gây bệnh.
a a a a a a b b b b b b b b b b b b 0 1 2 3 4 5 6 7
Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3
Thời gian( ngày) V òng v ô khu ẩ n( mm) KR2 KR3 KT3 KL2B KL KT1
Hình 14: Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn E.coli
(*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không
có ý nghĩa thống kê ở mức 5%).
Ở ngày đầu sau khi ủ, dòng KR2 cho thấy khả năng kháng khuẩn cao nhất (vòng vô khuẩn là 4,67 mm) và khả năng kháng khuẩn thấp nhất ở dòng KT1 (vòng vô khuẩn là 1,00 mm), tuy nhiên sự khác biệt giữa 2 dòng KR2 và dòng KR3 (vòng vô khuẩn là 4,17 mm) là không có ý nghĩa về mặt thống kê nhưng 2 dòng này khác biệt về mặt thống kê so với các dòng KT3, KL2B, KL, KT1.
Đến ngày thứ 2 sau khi ủ, vòng vô khuẩn tăng lên ở các dòng , đáng chú ý dòng KR3cho hiệu số cao nhất (vòng vô khuẩn là 5,20 mm) so với dòng KR2 (vòng vô khuẩn là 4,73 mm), sự khác biệt giữa 2 dòng này không có ý nghĩa thống kê nhưng 2 dòng KR2, KR3 khác biệt về mặt thống kê so với các dòng KT3, KL2B, KL, KT1. Trong đó, vòng vô khuẩn ở các dòng KT3, KL2B, KL, KT1tăng nhưng ít, 4 dòng này khác biệt không có ý nghĩa thống kê.
mm), 2 dòng này khác biệt có ý nghĩa so với 4 dòng còn lại. Điều này chứng tỏ dòng vi khuẩn KR2 (6,33 mm) có khả năng kháng khuẩn cao nhất và tốt nhất so với các dòng khác. Tuy nhiên, khả năng đối kháng của cả 4 dòng KT3, KL2B, KL, KT1 với vi khuẩn E.coli nhìn chung đều rất yếu.
Ngày 3
Ngày 2
Hình 15: Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn KR2, KR3với vi khuẩn
E.coli
Kết luận, trong 6 dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Gừng kháng vi khuẩn E.coli
có 2 dòng kháng mạnh nhất đó là dòng KR2, KR3, vòng vô khuẩn lên đến 6,33 mm, 6,17 mm ở ngày thứ 3 sau khi chủng. Kết quả nghiên cứu này so với dòng vi khuẩn nội sinh kháng khuẩn mạnh nhất trên cây Diếp Cá của Nguyễn Hữu Thiên Phúc (2013) có phần cao hơn (vòng vô khuẩn của dòng vi khuẩn R1 5,0 mm), đồng thời kết quả trên cũng cao hơn khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh trên cây Cúc Mui của Tô Hoàng Diễm (2013). Tóm lại hai dòng vi khuẩn KR2, KR3 là hai dòng vi khuẩn triển vọng cần nghiên cứu nhiều hơn để thay thế một số loại thuốc kháng sinh tổng hợp trong việc chống lại các vi khuẩn gây bệnh khác.
Bảng 16. Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn E.Coli
Thời gian ủ
1 ngày 2 ngày 3 ngày
Số dòng vi khuẩn
(Vòng vô khuẩn, mm) (Vòng vô khuẩn, mm) (Vòng vô khuẩn, mm)
KR2 4,67a 4,73a 6,33a KR3 4,17a 5,20a 6,17a KT3 1,33b 1,53b 1,67b KL2B 1,33b 1,47b 1,77b KL 1,17b 1,23b 1,53b KT1 1,00b 1,10b 1,20b CV (%) 30,69 18,26 14,76
(*Ghi chú: những giá trị trong cùng một cột có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa
thống kê ở mức 5%).
4.5.2. Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn gây bệnh Aeromonas hydrophila
Khi khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng VKNS phân lập được với vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh ở cá. Kết quả là 9 dòng vi khuẩn KT3, KCN1, KL2B, KT1B, KL, KCN2, KT1, KR2B, KR3B có khả năng tạo vòng sáng quanh khuẩn lạc chỉ sau 1 ngày sau khi ủ, chứng tỏ 9 dòng này đều có khả năng kháng lại vi khuẩn Aeromonas hydrophila. Dòng vi khuẩn KT3 cho thấy vòng vô khuẩn cao nhất (4,87 mm), chứng tỏ dòng vi khuẩn KT3có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất, kếđến là dòng vi khuẩn KCN1 (4,67 mm), KL2B (4,57 mm), KT1B (4,40 mm), KL (4,33 mm), KCN2 (4,20 mm), sự khác biệt về khả năng kháng khuẩn các dòng này không có ý nghĩa về mặt thống kê nhưng lại có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại là KT1, KR2B, KR3B, trong đó dòng vi khuẩn KR3B khả năng kháng khuẩn thấp nhất (vòng vô khuẩn là 2,13 mm).
Vòng vô khuẩn từ ngày 1 đến ngày 2 sau khi ủ vẫn không đổi ở cả 5 dòng KCN1, KT1B, KL, KCN2, KT1 ngoại trừ dòng KT3, KR2B, KR3Bcó tăng lên nhưng không đáng kể. Vòng vô khuẩn cao nhất vẫn là dòng KT3 (4,97 mm).
Đến ngày thứ 3 sau khi ủ, vòng vô khuẩn ở tất cả các dòng đều tăng nhưng rất ít ngoại trừ dòng KT1B, KL. Vòng vô khuẩn ở hai dòng vi khuẩn này đều giảm, riêng dòng KT1B có vòng vô khuẩn giảm đáng kể từ 4,40 mm giảm xuống còn 2,13 mm. Vòng vô khuẩn cao nhất ở ngày này là dòng KCN2 (5,6 mm), kếđến là dòng vi khuẩn KT3, KCN1, tuy nhiên3 dòng vi khuẩn này không khác biệt nhau về mặt thống kê, nhưng khác biệt có ý nghĩa thống kê đối với các dòng còn lại. Trong khi đó ở ngày 1, 2 dòng vi khuẩn KCN2 có khả năng kháng khuẩn ở mức thấp hơn dòng KT3 ( dòng vi khuẩn có hiệu suất kháng khuẩn cao nhất ở ngày 1,2) (Bảng 17). Điều này chứng tỏ
mỗi dòng vi khuẩn có đặc tính kháng khuẩn riêng.
Bảng 17. Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Thời gian ủ
1 ngày 2 ngày 3 ngày
Dòng vi khuẩn
(Vòng vô khuẩn, mm) (Vòng vô khuẩn, mm) Vòng vô khuẩn, mm)
KT3 4,87a 4,97a 5,33a KCN1 4,67a 4,67ab 5,00a KL2B 4,57a 4,47a 4,40bc KT1B 4,40ab 4,40abc 2,13d KL 4,33ab 4,33abc 4,67bc KCN2 4,20ab 4,20bc 5,60a KT1 3,83b 3,83c 4,17c KR2B 2,17c 2,23d 2,50d KR3B 2,13c 2,17d 2,47d CV (%) 10,18 10,1 8,74
(*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý
Ngày 2 Ngày 3
Hình 16: Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn KL2B, KT1 với vi khuẩn
Aeromonas hydrophila
Tổng quát, tro ng số 19 dòng phân lập được từ rễ, thân, lá, củ non, củ già của cây Gừng đem khảo sát thì thấy có 13 dòng vi khuẩn: KR2, KR3, KL2B, KL, KT3, KCN1, KT1B, KL, KCN2, KT1,KR2B, KR3B đều có khả năng kháng lại vi khuẩn gây bệnh. Trong đó, 4 dòng vi khuẩn KL2B, KL, KT3, KT1, vừa có khả năng kháng lại 2 loại vi khuẩn gây bệnh E.coli và Aeromonas hydrophila. Dòng KT3 cho khả năng đối kháng cao đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophila nhưng hiệu suất kháng lại vi khuẩn
E.Coli thấp. Ngược lại, 2dòng vi khuẩn KR2, KR3 kháng vi khuẩn E.Coli mạnh nhất nhưng lại không kháng Aeromonas hydrophila. Bên cạnh đó, hiệu quả kháng khuẩn
E.coli của 2 dòng vi khuẩn KR2, KR3 cao hơn nhiều so với các dòng vi khuẩn khác (đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất của dòng KR3 với E.coli là 6,33 mm). Điều này cho thấy các dòng vi khuẩn này có tiềm năng kháng lại vi khuẩn gây bệnh E.coli hiệu quả hơn so với vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá. Ngoài ra, ta thấy dòng KCN1 và KT1 kích thước vòng vô khuẩn không đổi ở ngày thứ 1 và ngày thứ 2 sau khi chủng nhưng đến ngày thứ 3 khả năng kháng khuẩn tăng, có thể giải thích ở
ngày thứ 2 sau khi chủng vi khuẩn nội sinh chưa thích ứng với môi trường nhưng đến ngày thứ 3 vi khuẩn đã thích ứng và phát triển tốt nên khả năng kháng khuẩn tăng. Tuy nhiên dòng KT1B có kích thước vòng vô khuẩn giảm ở ngày thứ 3 sau khi chủng so với ngày thứ 1 và thứ 2 sau khi chủng, có thể giải thích dòng vi khuẩn này đã sử dụng hết thức ăn trong môi trường nên tính kháng khuẩn không còn được tổng hợp. Ngoài ra, vi khuẩn gây bệnh có thể tạo ra tính kháng lại vi khuẩn nội sinh do vi khuẩn nội
sinh đã kích hoạt gen nào đó trong vi khuẩn gây bệnh làm cho chúng phát triển mạnh lên tiêu diệt lại vi khuẩn nội sinh. Hiện tượng này cũng giống như tính kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh trên người.
Theo kinh nghiệm dân gian đã sử dụng cây Gừng để chống lạnh, tiêu đờm, chống nôn, chữa đau bụng, ăn không tiêu, cảm ho, sát trùng trong đau răng, viêm amydales (Võ Văn Chi , 1999). Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu từ bảng 16 cho thấy các dòng vi khuẩn phân lập được có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh trên cá là Aeromonas hydrophila gây bệnh đốm đỏ trên cá. Vi khuẩn gây bệnh cá đã kháng rất nhiều kháng sinh mạnh và gây thiệt hại đáng kể cho các nhà nuôi trồng thủy sản (Tu Thanh Dung et al., 2008). Mặc khác, việc sử dụng kháng sinh điều trị đã gây chi phí cao và sự tồn dư kháng sinh trong sản phẩm thủy sản ảnh hưởng đến sức khỏe con người, còn là rào cản các doanh nghiệp Việt Nam trong xuất khẩu. Do đó, phát hiện khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh trên cá của cây Gừng sẽ góp phần không nhỏ
trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản
Theo nghiên cứu của Vachees et al. (1997), các chủng Pseudomonas có khả năng
ức chế sự phát triển của Staphylococcus, Escherichia coli và Aeromonas hydrophila
lên đến 96,7%. Một nghiên cứu mới đây cho thấy chủng vi khuẩn nội sinh
Pseudomonas aeruginosa được phân lập từ cải bắp dại (Brassica oleracea) có khả
năng chống lại các vi khuẩn gây bệnh như Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhi (vòng vô khuẩn dao động từ 12 mm - 25 mm) (Swetha sunkar, 2013). Arundhati và Paul (2013) cũng đã phân lập được các dòng vi khuẩn nội sinh từ rễ, thân và lá của cây đình lịch (Hygrophila spinosa) có khả
năng kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh, trong đó khả năng kháng lại vi khuẩn E. coli
a a a a ab a bc a a d abc ab bc abc ab a bc abb c c d d c c d d 0 1 2 3 4 5 6
Ngày 2 Ngày 4 ngày 6
Thời gian (ngày) V òng v ô khu ẩ n (mm) KT3 KCN1 KL2B KT1B KL KCN2 KT1B KR2B KR3B
Hình 17: Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn Aeromonas hydrophila
(*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không
có ý nghĩa thống kê ở mức 5%).
4.6. Kết quả nhận diện một số dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR
Sau khi kiểm tra các đặc tính sinh hóa của 19 dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA. Chọn 3 dòng vi khuẩn triển vọng nhất đó là dòng KR2, dòng KR3 và dòng KL2B thực hiện phương pháp PCR với đoạn mồi 16S-rDNA (Hình 18) 1500 bp 1 2 3 4 5 6 7 Hình 18: Phổđiện di các dòng vi khuẩn với cặp mồi 16S-rDNA
(*Ghi chú: Giếng 1: Thang chuẩn 100bp. Giếng 5,6,7 lần lượt là các mẫu thí nghiệm KR, KR3,
KL2B( Kích thước mẫu là 1.500bp.)
Sau khi đã khuếch đại DNA của các dòng vi khuẩn, chọn 3 dòng vi khuẩn KR2, KR3, KL2B gửi giải trình tự và định danh tại Công ty Macrogen, Korea.
Sử dụng công cụ Blast của NCBI để so sánh trình tự tương đồng với các trính tự
trên ngân hàng gen kết quảđã cho thấy trình tự của dòng KR2 có mức đồng hình 98% với 16s-rRNA của dòng vi khuẩn Enterobacter cloacae, dòng KR3 có mức đồng hình 95% với 16s-rRNA của dòng vi khuẩn Enterobacter cloacae, dòng KL2B có mức
đồng hình 95% với 16s-rRNA của dòng vi khuẩn Enterobacter kobei.
Bảng 18. Kết quả nhận diện các dòng vi khuẩn triển vọng STT Tên dòng Chiều dài DNA (bp) Kết quả giải trình tự Độ tương đồng (%) 1 KR2 1511 NR 028912.1 Enterobacter cloacae dòng 279-56 98% 2 KR3 1529 NR 117679.1 Enterobacter cloacae dòng DSM 30054 95% 3 KL2B 1451 NR_028993.1 Enterobacter kobei dòng CIP 82.92 95%
Nhìn chung, kết quả giải trình tự cho thấy rằng cả 3 dòng vi khuẩn KR2, KR3, KL2B được tuyển chọn đều có trình tự DNA tương đồng với các chủng lần lượt là
Enterobacter cloacae, Enterobacter cloacae, Enterobacter kobei với tỷ lệ đồng hình lần lượt là 98%, 95%, 95%. Trong đó, tỷ lệđồng hình của dòng KR3, KL2B lần lượt với chủng Enterobacter cloacae, Enterobacter kobei chỉ có 95%, điều này chứng tỏ
dòng KR3 có thể là một chủng mới có quan hệ gần gũi với chủng Enterobacter cloacae. Trong khi đó, dòng KL2B có thể là một chủng mới có quan hệ gần gũi với chủng Enterobacter kobei. Cả 3 dòng này đều có khả năng tổng hợp đạm, IAA và tạo vòng kháng khuẩn.
Theo Cao Ngọc Điệp và ctv (2006-2010), Enterobacter cloacae hoạt động như
những nhà máy sinh học, nó có thể phân giải các phân tử lân bị cố định trong đất hay cố định đạm từ khí trời và giải phóng những Phytohormon kích thích sự tăng trưởng của cây trồng. Vì vậy, Enterobacter cloacae là đối tượng nghiên cứu để tạo chế phẩm vi sinh có ích góp phần cải tạo đất nông nghiệp ởĐBSCL.
Theo Nathalie và ctv (2009) các dòng vi khuẩn khác nhau thuộc họ
Enteriobacteriacea (Enterobacter ludwigii, Raoultella terrigena, Klebsiella oxytoca) có khả năng cốđịnh đạm được phân lập từ các nốt rễ cây Medicago được trồng quanh nhà máy điện hạt nhân Chernobyl đã được tuyển chọn để sản xuất exopolysaccharides acid hòa tan trong nước.
Ở Nhật, các nhà nghiên cứu đã xác định được các vi khuẩn nội sinh
Herbaspirillum có khả năng cố định đạm ở các loài lúa hoang (Elbelatagy et al., 2001). Người ta cũng đã tiến hành thí nghiệm chủng vi khuẩn Herbaspirillum seropedicae và giống Burkholderia vào cây lúa, kết quả các vi khuẩn có thể cố định
đạm khoảng 19% tổng sốđạm cần thiết cho cây (Verma et al., 2001).
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các chủng Enterobacter cloacae, Enterobacter kobei vừa có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, hòa tan lân và đặc biệt là khả năng kháng khuẩn E.coli. Điều này chứng tỏ chúng là những dòng vi khuẩn sáng giá trong ngành công nghiệp dược, hứa hẹn có thể thay thế một số loại thuốc kháng sinh tổng hợp trong việc chống lại các tác nhân gây bệnh.
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Mười chín dòng vi khuẩn đã được phân lập từ rễ, thân, lá, củ non, củ già của cây Gừng. Trong đó có 6 dòng phân lập từ rễ, 5 dòng phân lập từ thân, 2 dòng phân lập từ
lá và 3 dòng phân lập từ củ non, 4 dòng phân lập từ củ già.
Tất cả 19 dòng vi khuẩn này đều có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA 10 dòng vi khuẩn là có khả năng hòa tan lân khó tan. Kết quả khảo sát khả năng kháng lại vi khuẩn E.coli và A. hydrophila, cho thấy có 6 dòng kháng được E.coli, 9 dòng kháng được A.hydrophila, 4 dòng vi khuẩn kháng lại cả hai loại vi khuẩn E.coli và A. hydrophila. Ba dòng vi khuẩn đem định danh là KR2, KR3 (2 dòng vi khuẩn kháng mạnh đối với vi khuẩn E.coli, và có khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA), KL2B (dòng vi khuẩn vừa có khả năng cốđịnh đạm, tổng hợp IAA, có khả năng kháng hai dòng vi khuẩn E.coli và A.hydrophila). Dòng KL2Bchính là dòng vi khuẩn có triển vọng ứng dụng trong điều trị bệnh cá và làm phân bón hữu cơ. Trong khi đó dòng KR2, KR3 kháng rất mạnh vi khuẩn E.coli, đây là hai dòng vi khuẩn tiềm năng hứa hẹn có thể thay thế một số loại thuốc kháng sinh tổng hợp trong việc chống lại các tác nhân gây bệnh.
Kết quả giải trình tự gene 16S-rDNA và so sánh với dữ liệu của ngân hàng gene NCBI, dòng KR2 được nhận diện là NR 028912.1 Enterobacter cloacae dòng 279-56, dòng KR3 được nhận diện là NR 117679.1 Enterobacter cloacae dòng DSM 30054 và dòng KL2B là NR_028993.1 Enterobacter kobei dòng CIP 82.92 với tỷ lệđồng hình lần lượt là 98%, 95% và 95%.
5.2 . Đề nghị
Khảo sát thêm những đặc tính kháng khuẩn của những dòng vi khuẩn phân lập có tính kháng khuẩn cao trên những dòng vi khuẩn hoặc nấm gây bệnh khác.
Ưng dụng các dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp ammonium, IAA và hòa tan lân khó tan cao trên cây dược liệu ngoài đồng ruộng.