2 .3.3.3 Vi khuẩn Azospirillum
3.1.5. Hóa chất và môi trường
3.1.5.1. Hóa chất dung để khử trùng mẫu
- Nước cất vô trùng - Ethanol (cồn) 70%
- Hydrogen peroxide (H2O2) 3%
3.1.5.2. Hóa chất dung để phân lập vi khuẩn nội sinh
- Hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn nội sinh trên môi trường PDA.
Môi trường khảo sát khả năng hòa tan lân
Bảng 1: Thành phần môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999)
Hóa chất Liều lượng (g/l) Sucrose 10 MgSO4.7H2O 0,25 Ca3PO4 5 MgCl2.6H2O 5 KCl 0,2 (NH4)2SO4 0,1 pH 7,0
Môi trường khảo sát khả năng tổng hợp NH4+
Bảng 2: Môi trường Burk không đạm (Park et al., 2005) Hóa chất Liều lượng (g/l) Sucrose 10 K2HPO4 0,52 MgSO4.7H2O 0,1 CaCl2 0,2 KH2PO4 0,41 KOH 4,5 Na2MoO4.2H2O 0,0025 FeSO4.7H2O 0,005 Na2SO4 0,05 pH 7,0
Bảng 3: Thành phần môi trường PDA
Khoai Tây 200g Dextrose 20g Agar 20g( đặc), 0,2g( bán đặc) Nước cất 1000ml pH 6.8 3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh
Trước khi thực hiện đề tài cần lấy mẫu đất sau đó chuyển về phòng thí nghiệm phân tích độ pH.
3.2.1.1. Xử lý mẫu
Rửa thật sạch đất bám ở rễ, thân, lá, củ non, củ già.
Sau đó cắt rễ, thân và lá thành những đoạn nhỏ 2 - 3cm, riêng củ già , củ non ta lấy khoảng một đoạn nhỏ.
Khử trùng bằng dung dịch ethanol 70% trong 30 giây và rửa lại với nước cất vô trùng.
Tiếp tục khử trùng mẫu bằng dung dịch H2O2 3% (trong 3 phút) và rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng.
3.2.1.2. Pha loãng mẫu
Sau khi khử trùng mẫu xong, cắt chúng thành những đoạn thật nhỏ rồi đem nghiền mịn trong cối cùng với 1mL nước cất vô trùng.
Tiến hành pha loãng mẫu ở các nồng độ 10-1, 10-2
3.2.1.3. Cấy mẫu
Lấy 50µL dung dịch pha loãng ở trên cấy trải vào đĩa chứa môi trường PDA
đặc có bổ sung kháng sinh rồi đem ủở 30oC để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển. Sau khoảng 24- 36 giờ nuôi, khi thấy khuẩn lạc phát triển trên bề mặt môi trường thì ta tiến hành chọn các loại khuẩn lạc khác biệt nhau rồi cấy sang đĩa petri chứa môi trường PDA đặc và tiếp tục đem ủ ở 30oC trong tủ ủ để vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và phát triển đến khi ròng.
Tiếp tục theo dõi thường xuyên sự tăng trưởng của vi khuẩn và phân lập nhiều lần để tách ròng vi khuẩn.
3.2.1.4. Trữ mẫu
Trữ vi khuẩn đã phân lập ròng trong ống nghiệm chứa môi trường PDA có bổ
sung đạm (1gKNO3/L).
3.2.2. Quan sát hình dạng và khả năngchuyển động của vi khuẩn
Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát sự chuyển động của vi khuẩn trong môi trường nước cất vô trùng. Chuẩn bị mẫu vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép, rồi quan sát dưới kính hiển vi quang học ởđộ phóng đại 400 lần.
Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn như sau:
- Nhỏ 10µL nước cất vô trùng lên kính mang vật.
- Kim cấy được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
- Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật 1 góc 45o rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ
nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí.
Để đo kích thước vi khuẩn ta dùng thước trắc vi thị kính và thước trắc vi vật kính như sau:
- Thước trắc vi thị kính là một miếng kính tròn trên đó chia thành 100 vạch, nó
được đặt giữa hai thấu kính của thị kính.
- Thước trắc vi vật kính được đặt trên một miếng kính đặc biệt dài khoảng 2mm
được chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng có độ dài 10µm - Phương pháp đo kích thước vi khuẩn như sau:
- Đặt thước trắc vi vật kính vào bàn kính, điều chỉnh sao cho thấy rõ ảnh của thước.
- Xê dịch thước trắc vi vật kính và xoay thước trắc vi thị kính sao cho hai thước song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính sao cho một vạch của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính và một vạch thứ hai nào của thước trắc vi vật kính trùng với thước trắc vi thị kính. - Đếm số khoảng cách của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính. - Trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính được tính theo công thức sau:
x: Trị số 1 khoảng cách của thước trắc vi thị kính N: Số khoảng cách của thước trắc vi vật kính, N = 6 n: Số khoảng cách của thước trắc vi thị kính, n = 35
Ta có:
- Thay thước trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của vi mẫu. - Di chuyển vi mẫu sao cho một đầu của mẫu đo trùng với một vạch của thước
trắc vi thị kính, từđó tìm một vạch thứ hai trùng với đầu kia của mẫu đo.
Đếm số khoảng cách thước trắc vi nằm trong hai vạch này.
- Tính kích thước vi mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng của hai thước nhân với trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
3.2.2.1. Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh
Sau khi quan sát và đo kích thước các tế bào vi khuẩn xong, ta tiến hành nhuộm Gram các vi khuẩn.
Trình tự nhuộm Gram được thực hiện như sau:
- Lấy 10µL nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật.
- Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải mỏng vi sinh vật trên kính mang vật.
- Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cốđịnh vi sinh vật trên kính mang vật.
- Nhỏ từ một đến hai giọt crystal violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật đã cốđịnh, trải đều crystal violet bằng que cấy và để 2 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước.
- Nhỏ từ một đến hai giọt dung dịch iod rồi trải đều bằng que cấy và để trong 1 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
- Rửa lại bằng cồn 70o thật nhanh để tẩy màu từđầu đến cuối kính mang vật sau cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô.
- Nhỏ từ một đến hai giọt fushin rồi trải đều bằng que cấy sau đó để 1 phút. - Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không còn màu của
fushin.
- Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước.
- Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của crystal violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của fushin là mẫu Gram âm.
3.2.2.2.Xác định khả năng tổng hợp NH4+
a.Nguyên tắc
Xác định nồng độ NH4+ nhờ phản ứng phenol và NH3 với sự hiện diện của tác nhân oxy hóa là hypochlorite hình thành có phức màu xanh, dưới pH kiềm. Sự hiện diện của sodium nitroprusside làm tăng hiệu quả của phản ứng giữa NH3 với phenol và lên khoảng 10 lần (Page et al., 1982)
b.Hóa chất:
- Chuẩn bị dung dịch KCl2 M: Hòa tan 15 g KCl vào trong 100 ml nước cất. - Stock (NH4+): Hòa tan 0,4717g (NH4)2SO4 vào 1 lít nước. Trữ dung dịch trong
tủ lạnh. Trước khi sử dụng pha loãng 4ml stock (NH4+) với 196 ml dung dịch KCl 2M đểđược 200ml, sau cùng được dung dịch 2µg/ml.
- Thuốc thử phenol nitroprusside: hòa tan 5g phenol và 0,025g nitroprusside trong nước được 0,5L.
- Hypochloride buffer: hòa tan 15ml NaOCl + 5g NaOH vào nước được 0,5L. - Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường NFb lỏng
c.Tiến hành thí nghiệm:
- Cho 15ml môi trường lỏng NFb, New và Burk vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ướt 121oC trong 20 phút.
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần. - Nuôi cấy các dòng vi khuẩn trên máy lắc 200 vòng/phút.
* Định lượng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng) d.Phương pháp định lượng:
+ Chuẩn bị thuốc thử phenol nitroprusside: cân chính xác 5g phenol và 0,025g nitroprusside hòa tan thêm nước cất vào đến 0,5L.
+ Pha buffer: cho 1ml NaOCl có nồng độ (5 – 5,25 %) và 5 g NaOH vào 0,5L nước cất.
Hình 4: Sự thay đổi màu của dãy dung dịch NH4+ theo phương pháp Indophenol Blue
( *Ghi chú từ trái sang phải của hình là 0,1, 2, 3, 4 và5µg/ml)
(Hình chụp ngày 2/10/2014)
• Đường chuẩn 0 ppm gồm có: 5ml H2O: 0ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử
• Đường chuẩn 1 ppm gồm có: 4ml H2O: 1ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử
• Đường chuẩn 2 ppm gồm có: 3ml H2O: 2ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử
• Đường chuẩn 3 ppm gồm có: 2ml H2O: 3ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử
• Đường chuẩn 4 ppm gồm có: 1ml H2O: 4ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử
• Đường chuẩn 5 ppm gồm có: 0ml H2O: 5ml NH4+, 5ml buffer, 5 ml thuốc thử
+ Đo nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn
• Hút 1,5ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf. • Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
• Hút 1ml dịch vi khuẩn đã ly tâm và 4ml H2O, 5ml buffer, 5ml thuốc thử. Tiến hành đo phổ OD.
• Dựa vào sự thay đổi màu của phản ứng giữa thuốc thử và NH4+, đo OD ở
3.2.2.3. Xác định khả năng hòa tan lân khó tan
Dùng micropipette hút lần lượt 5µl dd VKNS từ mỗi ống nghiệm môi trường tăng sinh PDA lỏng có bổ sung yeast extract 1% nhỏ lên đĩa môi trường chứa lân khó tan (NBRIP) đặc (Bảng 3), mỗi đĩa 1 dòng, 3 lần lặp lại. Sau đó ủở 30oC, theo dõi sự
phát triển của chúng từ 1 - 2 ngày, dòng nào phát triển được trên môi trường NBRIP thì có khả năng hòa tan lân khó tan. Quan sát và đo đường kính vòng halo, khuẩn lạc mỗi ngày.
Độ hữu hiệu của các dòng vi khuẩn hòa tan lân khó tan
Hiệu quả hòa tan lân E được tính theo công thức:
3.2.2.4. Thí nghiệm khảo sát khả năng tổng IAA của một số dòng vi khuẩn phân lập
Đường kính halo
E = x 100 (C. NGUYEN và ctv, 1992) Đường kính khuẩn lạc
a. Chuẩn bị
- Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường NFb, New và Burk lỏng.
- Cho 15 ml môi trường lỏng NFb, New và Burk vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ướt 121oC trong 20 phút.
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần.
- Nuôi cấy các dòng vi khuẩn trên máy lắc 200 vòng/phút. Trùm kín các ống nghiệm trong bọc nylon đen để tránh IAA tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng (vì chúng dễ
bị phân hủy dưới ánh sáng)
b. Định lượng IAA bằng phương Salkowski (Glickmann và Dessaux,1995) trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng)
1. Chuẩn bị thuốc thử Salkowski R2: 4,5 g FeCl3 trong 1lít H2SO4 10,8 M. 2. Chuẩn bị phosphat buffer 200 ml:
B: K2HPO4 0,174g/100ml nước cất.
3. Lấy 39 ml A, 61 ml B cho thêm nước cất vừa đủ 200 ml, chỉnh pH = 7 4. Hút 1,5 ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf. 5. Ly tâm 5500 vòng/phút trong 10 phút.
6. Hút cẩn thận 1 ml phần dịch trong sau khi ly tâm cho vào ống Durham.
7. Ủ hỗn hợp trên trong tối 10 phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn sau đó đo quang phổ OD ở bước sóng 530 nm.
8. Chuẩn bịđường chuẩn IAA:
Cân 0,0016 g IAA thương mại hòa tan với 10 ml phosphat buffer được nồng độ
là 160 µg/l. Sau đó pha loãng ra các nồng độ 2,5; 5; 10; 15; 20; 30; 40; 80 µg/ml.
80 40 30 10 20 5 2.5 0
Hình 5: Sự thay đổi màu của dãy dung dịch IAA theo phương pháp Salkowski
(*Ghi chú: từ trái qua phải của hình là 0; 2,5; 5; 10; 20; 30; 40; 80 µg/ml)
(Hình chụp ngày 2/10/2014)
9. Kết quả đo phổ OD vẽ thành đường chuẩn IAA trên excel với trục tung là OD có giá trị từ 0 – 3. Trục hoành là nồng độ IAA có giá trị từ 0 – 80 µg/ml.
10. Kết quả đo OD ở bước song 530nm các dòng vi khuẩn phân lập được thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn, từđó tính được nồng độ IAA đã được vi khuẩn tổng hợp.
11. Các số liệu thu thập được xử lý bằng Excel và phầm mềm thống kê Minitab.
3.2.2.4.Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập
• Chuẩn bị môi trường PDA.
• Dùng giấy thấm đường kính 6mm nhúng vào dịch vi khuẩn phân lập được nuôi tăng sinh trong môi trường PDA lỏng và đặt giấy thấm lên bề mặt môi trường
đã trải vi khuẩn gây bệnh.
• Ủ 30°C trong 12h – 24h. Quan sát khả năng tạo vòng kháng khuẩn.
• Đo đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng sáng trong 3 ngày liên tiếp.
Đường kính vòng vô khuẩn được tính bằng công thức (D. Hernández et al., 2005):
Đường kính vòng vô khuẩn = Đường kính vòng sáng – Đường kính khuẩn lạc
3.2.2.5. Nhận diện các dòng vi khuẩn phân lập
Sau khi kiểm tra khả năng cốđịnh đạm, tổng hợp IAA và khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn đã phân lập được, chọn một số dòng vi khuẩn có khả
năng cốđịnh đạm, tổng hợp IAA và khả năng kháng khuẩn cao để thực hiện kiểm tra bằng kỹ thuật PCR.
Quy trình trích DNA từ khuẩn lạc của Trần Nhân Dũng (2011)
- Chọn 10 khuẩn lạc ròng, cho vào tuýp 2,2ml. ( Ưu tiên chọn những khuẩn lạc lẻ, rời)
- Cho 1 viên bi sắt vào tuýp và lắc bằng máy lắc.
- Cho vào 1 ml Lysis buffer, lắc đều, ủở nhiệt độ phòng trong 10 phút. - Ly tâm 13000 rpm/5 phút, lấy phần dung dịch chuyển sang tuýp mới.
- Cho một lượng tương đương Ethanol 95%, ly tâm 13000 rpm/5 phút, bỏ phần dung dịch phía trên.
- Rửa phần tủa bằng 500 µl Ethanol 70%, ly tâm 13000 rpm/5 phút. - Sấy khô chân không trong 10 phút (45oC).
- Hòa tan trong 100 µl TE 0,1X. - Trữở -20 oC.
- Nhận diện các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR.
- Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ ( cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ
gồm 3 bước :
Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử,
thường là 94oC - 95oC trong 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn biến tính (denaturation).
Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi (primers) bắt cặp với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC - 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn bắt cặp (annealing).
Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc vào
độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Đây là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation).
- Sau khi ly trích DNA từ các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Gừng, phản ứng PCR gen 16S-rDNA (Lane, 1985) sử dụng đoạn mồi:
27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’ 1492R 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’
- Sau khi trích DNA các dòng vi khuẩn, sẽ tiến hành phản ứng PCR bằng máy PCR Bio-Rad DNA Engine.
Bảng 4: Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen
Bước phản ứng Tên bước Số lượng chu kỳ Nhiệt độ (oC ) Thời gian
1 Biến tính 95 5 phút
Biến tính 95 1 phút
2 Gắn mồi 30 53 30 giây
Kéo dài 72 90 giây
3 Kéo dài 72 5 phút