2 .3.3.3 Vi khuẩn Azospirillum
2.3.4.3. Khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) của vi khuẩn nội sinh
sinh.
Indole -3- acetic acid (IAA) hay còn gọi là auxin, là chất điều hòa chủ yếu của sự
sinh trưởng thực vật. IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự giãn dài tế bào, phân hóa sinh mô, phát triển trái và hạt, chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng.
Vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật như việc cốđịnh đạm VKNS. Ngoài ra, vi khuẩn còn sản sinh tổng hợp auxin, cytokinin tác động đến quá trình tổng hợp ethylene của cây, có vai trò trung tâm trong sự tăng trưởng thực vật, chất điều hòa quá trình sinh học từ phân chia tế bào, kéo dài, phân hóa sinh mô, phát triển trái và hạt. Nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng tổng hợp IAA (Glick, 1995).
Trong tự nhiên, IAA có hai dạng: IAA liên kết (CH2-COO-R) và IAA tự do (R- CH2COOH). Chỉ có IAA tự do điều khiển các hoạt động sinh lý của thực vật, đặc trưng là sự tăng trưởng của cây qua sự tăng trưởng của tế bào (Suzuki et al., 2003).
Xét cơ chế tổng hợp IAA của vi khuẩn Pseudomonas cho thấy L-Tryptophan
đóng vai trò quan trọng, được xem là tiền chất trong lộ trình tổng hợp IAA của các thực vật lẫn vi sinh vật. Có 3 lộ trình tiêu biểu nhất cho sự biến đổi của L- tryptophan thành IAA đã được Koga et al., (1991) mô tả chi tiết như sau:
• Lộ trình indole -3- pyruvic acid
Tryptophan Æ indole -3- pyruvic acid Æ indole -3- acetaldehyde Æ IAA
• Lộ trình tryptamine
Tryptophan Æ tryptamine Æ indole -3- acetaldehyde Æ IAA
• Lộ trình indole -3- acetamide
Tryptophan Æ indole -3- acetamine Æ IAA
2.3.4.4 Khả năng đối kháng sinh học của vi khuẩn nội sinh với một số vi sinh vật gây bệnh
a. Khả năng đối kháng sinh học (biocontrol)
Vi khuẩn nội sinh có thể có khả năng làm yếu đi hay ngăn cản tác hại của các vi sinh vật gây hại. Một trong những sự đóng góp của vi khuẩn nội sinh từ thực vật là
một vài vi khuẩn nội sinh từ những thực vật khác nhau đã cho thấy hoạt tính sinh học tiềm năng như hoạt động kháng khuẩn (Ravikumar et al., 2010), kháng nấm (Cho et al., 2007) và chống ung thư (Taechowisan et al., 2007). Một vi khuẩn nội sinh tổng hợp các chất hóa học có trong thực vật, nhiều loài có khả năng tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật để bảo vệ chống lại các tác nhân gây bệnh và một số
các hợp chất này đã được chứng minh bằng việc khám phá ra các loại thuốc kháng sinh hữu ích. Sự đa dạng của các hợp chất được tạo ra bởi các vi khuẩn nội sinh đã
được chứng minh để chống lại tác nhân gây bệnh và thậm chí cả bệnh ung thưở động vật bao gồm cả con người. Nhiều thí nghiệm đã chứng minh vai trò của vi khuẩn nội sinh trong việc ngăn chặn sự tác hại của nấm Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum
trên bông vải (Chen et el., 1995); nấm Fusarium oxysporum f. sp. pisi trên đậu pea (Benhamou et al., 1996), Verticillium albo-atrum và Rhizoctonia solani trên khoai tây (Nowak et al., 1995), Rhizoctonia solani trên khoai tây (Pleban et al., 1995) và lúa (Krishnamurthy và Gnanamanickam, 1997)…Một nghiên cứu gần đây của Swetha Sunkar et al. (2013), một loại vi khuẩn nội sinh đã được xác định là vi khuẩn
Pseudomonas aeruginosa được phân lập từ có khả năng chống lại một số vi khuẩn gây bệnh như Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli và
Salmonella typhi.
Nhiều giống VKNS nhưPseudomonas, Burkholderia và Bacillus (Lodewyckx et al., 2002) được biết là những loài trong những giống vi khuẩn tổng hợp ra nhiều sản phẩm thứ cấp bao gồm các kháng sinh, chất kháng ung thư, hợp chất hữu cơ thơm, kháng nấm, kháng virus, kháng sâu... và những sản phẩm thứ cấp này được trích ly từ
sự lên men của những loài vi khuẩn này (Ryan et al., 2008).
b. Một số vi khuẩn gây bệnh phổ biến
* Escheriachia coli (E.coli)
Vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) thuộc họ Enterobacteriaceae, họ vi khuẩn thường trực ở trong ruột, chiếm tới 80% các vi khuẩn hiếu khí vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực đường tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây nhiều bệnh ở đường ruột và ở
các cơ quan khác (Lê Văn Tạo, 1997). Theo Nguyễn Như Thanh et al. (1997), E.coli là một trực khuẩn ngắn 2 đầu tròn, kích thước 2 - 3 µm. Trong cơ thể có hình cầu trực khuẩn đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Trong môi trường nuôi cấy, có khi
động do có tiêm mao ở xung quanh thân, nhưng cũng có một số chủng không có khả
năng di động. Vi khuẩn không sinh nha bào, có thể có giáp mô.
Trong điều kiện bình thường E. coli khu trú thường xuyên ở phần sau của ruột, ít khi có ở dạ dày hay đoạn đầu ruột non của động vật. Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát triển nhanh về số lượng, độc lực, gây loạn khuẩn, bội nhiễm đường tiêu hóa và trở thành nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978).
Hình 3: Vi khuẩn Escherichia coli
(*Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/File:EscherichiaColi_NIAID.jpg, ngày 17/11/2014)
*Aeromonas hydrophila
Trước đây, Aeromonas thuộc họ Vibrionaceae do chúng có một vài đặc điểm tương tựVibrio. Nhưng đến giữa thập niên 80 Aeromonasđược tách ra một họ riêng là Aeromonadaceae (Honerman và Moris, 2007), bởi có các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa khác biệt như không mẫn cảm với phản ứng O/129 (150µg) ngoại trừA. caviae (Trích dẫn bởi Nguyễn Hà Giang, 2008).
Theo Barrow và Feltham (1993), Aeromonas chia thành 2 nhóm dựa trên khả
năng di động và ngưỡng nhiệt độ phát triển của chúng. Nhóm thứ nhất gồm: A. hydrophila, A. sobria và A. caviae có các đặc điểm là có khả năng di động, hai đầu hơi tròn, Gram âm, hình que ngắn, hiếu khí không bắt buộc, phát triển được ở 37oC… nhóm thứ hai là A. salmonicida (có ba loài phụ gồm: A. salmonicada, A. achromogenes và A. nova) có đặc điểm tương tự nhưng chúng chỉ phát triển tốt nhất ở
22oC hoặc thấp hơn và không có tiêm mao cũng như chúng không có khả năng di động (Trích dẫn bởi Nguyễn Hà Giang, 2008).
Shotts và Rimler (1973), Aeromonas hydrophila có những đặc trưng sau: Gram âm, que thẳng, kích thước khoảng 0,5x1,4 - 4,0 µm, có roi ở 2 cực cơ thể, kỵ khí, lên men carbonate hình thành acid hoặc khí gas, oxydase dương tính, khử nitrate.
Aeromonas hydrophila khi phát triển trên môi trường đặc trưng SA sẽ cho các khuẩn lạc có dạng tròn, hơi lồi, nhẵn và có màu vàng nhạt (Nguyễn Thị Thu Hằng, 2005).
B. Austin và D. Austin (1986), cho rằng A. hydrophila là nguyên nhân của một vài tình trạng bệnh khác nhau như thối vây, bệnh đốm đỏ và thường liên kết với mầm bệnh khác nhưA. salmonicida. Theo Lewis và Plumb (1979) cho rằng trong các chủng vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thì A. hydrophila được xem là chủng gây bệnh cho cá nước ngọt quan trọng nhất, gây bệnh nhiễm trùng máu, xuất huyết ở những loài cá nuôi và cá tự nhiên, theo Angka (1990), A. hydrophila cũng gây bệnh lở loét cho cá tại Java-Indonesia và gây tỷ lệ chết từ 80-90%. Bên cạnh đó, trong báo cáo của Saitanu et al. (1982) đã tìm thấy vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh xuất huyết do bệnh nhiễm trùng máu trên cá chép.
2.4. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật cốđịnh đạm trên thế giới và trong nước 2.4.1. Trên thế giới
Hiện nay người ta đã tìm được nhiều giống VKNS như: Azoarcus, Enterobacter, Agrobacterium, Pseudomonas, Clavibacter, Bacillus, Brudyrhizobium, Azospirillum, Cellulomonas, Pantoea, Klebsiella, Gluconacetobacter, Burkholderia, Corynebacterium, Rhizobium, Herbaspirillum… ở các cây lương thực, cây hoa màu, cây họ đậu và cây cỏ… Berg et al. (1980) nghiên cứu đặc tính sinh học của
Azospirillum cộng sinh ở cây mía giúp tăng cường hoạt tính của enzyme nitrogenase từ đó làm tăng tỉ lệ tổng hợp đạm của cây.
Ở Thụy Điển, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy ở vùng rễ của các loài ngũ cốc và cỏ chăn nuôi các vi khuẩn Enterobacter và Bacillus (Lindberg và Granhall, 1984).
Ở Nhật, các nhà nghiên cứu đã xác định được các VKNS Herbaspirillum có khả
năng cốđịnh đạm ở các loài lúa hoang (Elbelatagy et al., 2001). Người ta cũng đã tiến hành thí nghiệm chủng vi khuẩn Herbaspirillum seropedicae và giống Burkholderia
vào cây lúa, kết quả các vi khuẩn có thể cố định đạm khoảng 19% tổng số đạm cần thiết cho cây (Verma et al., 2001).
Ở Mỹ, mất hơn 6 năm nghiên cứu ở 4 loại cây trồng (bắp, lúa miến, đậu tương và lúa mì) và 27 loại cỏ tự nhiên khác nhau người ta đã xác định được 15 giống VKNS:
Agrobacterium, Bacillus, Bradyrhizobium, Erwinia, Cellulomonas, Clavibacter, Corynebacterium, Enterobacterium, Escherichia, Klebsiella, Microbacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Rothia và Xanthomonas (Zinniel et al., 2002). Trong đó số vi khuẩn Gram dương xấp xỉ bằng số vi khuẩn Gram âm.
Ở Ấn Độ, khi nghiên cứu ở 4 loài lúa trồng khác nhau người ta đã xác định được VKNS Gluconacetobacter diazotrophicus có khả năng cố định đạm nhờ vào gen nif
(Muthukumarasamy et al., 2002).
Trong những năm gần đây, do sự đa dạng rất lớn và tiềm năng chưa được khai thác của VKNS, chúng xuất hiện như một nguồn thay thế các sản phẩm có hoạt tính sinh học tự nhiên với các ứng dụng tiềm năng trong ngành công nghiệp dược phẩm. Do đó, VKNS đã gây sự chú ý trong ngành công nghiệp dược phẩm. Hiện nay trên thế
giới đang tập trung nghiên cứu ra các chủng VKNS từ cây thảo dược có khả năng kháng sinh nhằm phục vụ cho ngành dược.
Chu-long Zhang et al. (2009) đã phân lập được chủng VKNS từ cây thảo dược dâm dương hoắc (Epimedium brevicornu Maxim) có khả năng ức chế mạnh các loài
Alternaria alternata, Sclerotinia sclerotiorum, Verticillium dahliae, Botrytis cinerea
và Botrytis fabae, và sau khi phân tích trình tự gen 16S và thử nghiệm các đặc tính vật lý và hóa học đã xác định được chủng Phyllobacterium. Sudipta Roy và Debdulal Banerjee (2010) đã phân lập được các chủng VKNS từ cây dược liệu dừa cạn (Vinca rosea) có khả năng tạo kháng sinh và sau khi thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn với các vi khuẩn gây bệnh như Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae, Vibrio cholerae, Escherichiae coli và Candida albicans, kết quả cho thấy chủng Vrb 46 (được cho là tương tự như chủng Bacillus coagulans) có khả năng đối kháng với tất cả các loài vi khuẩn gây bệnh trên.
2.4.2 Trong nước
Ở nước ta, việc nghiên cứu các VKNS có khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp kích thích tố IAA ở các cây nông nghiệp đã được tiến hành khá nhiều trong những năm gần đây. Tại Viện Nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học - Đại học Cần Thơ, Nguyễn Hữu Hiệp et al. (2005) đã phân lập và nhận diện các dòng
ruộng lúa. Gần đây, Nguyễn Hữu Hiệp et al. (2008) phân lập được một số dòng vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus nội sinh ở rễ, thân và lá của các giống mía trồng tại huyện Cù Lao Dung và huyện Mỹ Tú, Tỉnh Sóc Trăng.
Đến nay, Việt nam đã có nhiều công trình nghiên cứu cây dược liệu nhưng phần lớn các nghiên cứu này chỉ tập trung khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cây dược liệu thông qua các nghiên cứu điều trị lâm sàng. Tuy nhiên, việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật nội sinh hoặc sống ở vùng rễ cây dược liệu có khả kích thích cây phát tiển tốt thông qua khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp hormone tăng trưởng kích thích cây dược liệu phát triển, góp phần giảm các loại bệnh, giảm chi phí sản xuất và
đặc biệt là khả năng tổng hợp các hoạt chất kháng khuẩn của chúng khi sống nội sinh với cây chưa được quan tâm nhiều. Vì vậy, việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật hữu ích này để phát triển cây dược liệu có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả hơn, nhằm thay thế các loại kháng sinh tổng hợp giúp giảm tỷ lệ kháng thuốc ở một số mầm bệnh nguy hiểm sẽ mang nhiều ý nghĩa quan trọng trong giai đoạn hiện nay.
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Thời gian
Từ tháng 6 đến tháng 11/2014
3.1.2. Địa điểm
- Thí nghiệm phân lập được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
- Thí nghiệm phân tích sinh hóa được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường hoặc phòng thí nghiệm sinh hóa, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.3. Vật liệu
- Thu mẫu cây Gừng, Gừng được trồng ở tỉnh Vĩnh Long.
- Vi khuẩn E.coli được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ
Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
- Vi khuẩn Aeromonas hydrophila do khoa Thủy sản Trường Đại Học Cần Thơ
cung cấp. 3.1.4. Dụng cụ và thiết bị Bình tam giác Micropipet Đĩa petri, ống nghiệm Ống trữ mẫu Ống đong 10ml, 100ml Cốc thủy tinh 10ml, 100ml, 200ml Kẹp, kim cấy, que trãi mẫu, đèn cồn Lame, Lammelle
Máy Vortex Tủ cấy vi sinh vật
Tủủ vi sinh vật Máy lắc mẫu Cân điện tử
3.1.5. Hóa chất và môi trường
3.1.5.1. Hóa chất dung để khử trùng mẫu
- Nước cất vô trùng - Ethanol (cồn) 70%
- Hydrogen peroxide (H2O2) 3%
3.1.5.2. Hóa chất dung để phân lập vi khuẩn nội sinh
- Hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn nội sinh trên môi trường PDA.
Môi trường khảo sát khả năng hòa tan lân
Bảng 1: Thành phần môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999)
Hóa chất Liều lượng (g/l) Sucrose 10 MgSO4.7H2O 0,25 Ca3PO4 5 MgCl2.6H2O 5 KCl 0,2 (NH4)2SO4 0,1 pH 7,0
Môi trường khảo sát khả năng tổng hợp NH4+
Bảng 2: Môi trường Burk không đạm (Park et al., 2005) Hóa chất Liều lượng (g/l) Sucrose 10 K2HPO4 0,52 MgSO4.7H2O 0,1 CaCl2 0,2 KH2PO4 0,41 KOH 4,5 Na2MoO4.2H2O 0,0025 FeSO4.7H2O 0,005 Na2SO4 0,05 pH 7,0
Bảng 3: Thành phần môi trường PDA
Khoai Tây 200g Dextrose 20g Agar 20g( đặc), 0,2g( bán đặc) Nước cất 1000ml pH 6.8 3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh
Trước khi thực hiện đề tài cần lấy mẫu đất sau đó chuyển về phòng thí nghiệm phân tích độ pH.
3.2.1.1. Xử lý mẫu
Rửa thật sạch đất bám ở rễ, thân, lá, củ non, củ già.
Sau đó cắt rễ, thân và lá thành những đoạn nhỏ 2 - 3cm, riêng củ già , củ non ta lấy khoảng một đoạn nhỏ.
Khử trùng bằng dung dịch ethanol 70% trong 30 giây và rửa lại với nước cất vô trùng.
Tiếp tục khử trùng mẫu bằng dung dịch H2O2 3% (trong 3 phút) và rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng.
3.2.1.2. Pha loãng mẫu
Sau khi khử trùng mẫu xong, cắt chúng thành những đoạn thật nhỏ rồi đem nghiền mịn trong cối cùng với 1mL nước cất vô trùng.
Tiến hành pha loãng mẫu ở các nồng độ 10-1, 10-2
3.2.1.3. Cấy mẫu
Lấy 50µL dung dịch pha loãng ở trên cấy trải vào đĩa chứa môi trường PDA
đặc có bổ sung kháng sinh rồi đem ủở 30oC để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển. Sau khoảng 24- 36 giờ nuôi, khi thấy khuẩn lạc phát triển trên bề mặt môi trường thì ta tiến hành chọn các loại khuẩn lạc khác biệt nhau rồi cấy sang đĩa petri chứa môi trường PDA đặc và tiếp tục đem ủ ở 30oC trong tủ ủ để vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và phát triển đến khi ròng.
Tiếp tục theo dõi thường xuyên sự tăng trưởng của vi khuẩn và phân lập nhiều lần để tách ròng vi khuẩn.
3.2.1.4. Trữ mẫu
Trữ vi khuẩn đã phân lập ròng trong ống nghiệm chứa môi trường PDA có bổ
sung đạm (1gKNO3/L).
3.2.2. Quan sát hình dạng và khả năngchuyển động của vi khuẩn
Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát sự chuyển động của vi khuẩn trong môi trường nước cất vô trùng. Chuẩn bị mẫu vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép, rồi quan sát dưới kính hiển vi quang học ởđộ phóng đại 400 lần.
Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn như sau:
- Nhỏ 10µL nước cất vô trùng lên kính mang vật.
- Kim cấy được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
- Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật 1 góc 45o rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ
nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí.
Để đo kích thước vi khuẩn ta dùng thước trắc vi thị kính và thước trắc vi vật kính như sau:
- Thước trắc vi thị kính là một miếng kính tròn trên đó chia thành 100 vạch, nó