3. Vật liệu, nội dung và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.1.1.Đối t−ợng nghiên cứu
Bệnh lở cổ rễ do nấm Rhizoctonia solani Kuhn gây ra trên các cây trồng cạn nh− : đậu đũa, đậu xanh, cà chua, d−a chuột, đậu cô ve, bí xanh, cà bát, su hào, bắp cảị
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
+ Các dụng cụ trong phòng thí nghiệm bao gồm:
- Tủ lạnh, tủ định ôn, buồng cấy, nồi hấp, kính hiển vi điện tử, kính soi nổi, bếp điện, cân điện tử, cân bàn.
- Đĩa petri, bình tam giác, bình định mức, ống đong, dao cắt, đèn cồn, đũa khuấy thủy tinh, que cấy, panh, khay đựng, túi nilon, vải lọc, giẻ lau, bông, giấy báo, giấy bạc ...
- Hóa chất : Đ−ờng glucose, Agar, cồn, n−ớc cất ... + Các dụng cụ phụ vụ điều tra và thí nghiệm bao gồm :
- Cuốc, dao, bình t−ới n−ớc, đất khử trùng, khay đựng, chậu trồng cây ...
3.1.3. Môi tr−ờng để phân lập và nuôi cấy nấm
3.1.3.1. Môi tr−ờng n−ớc cất – agar (WA)
- Thành phần:
Agar: 20 g
N−ớc cất: 1000 ml
- Ph−ơng pháp điều chế: đun sôi n−ớc cất, cho từ từ Agar vào vừa cho vừa khuấy cho tan đều, đổ ra bình tam giác và cho thêm n−ớc cất vừa đủ 1000 ml, bit kín miệng bình tam giác bằng giấy bạc, hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C (1.5 atm) trong 30 phút. Hấp xong để nguội đến 550C, rồi đổ vào đĩa petrị
- Môi tr−ờng WA nghèo dinh d−ỡng nên ít bị tạp chất, do đó chủ yếu đ−ợc sử dụng để phân lập mẫu bệnh và tạo nguồn nấm ban đầụ
3.1.3.2 Môi tr−ờng khoai tây – gluco – agar (PGA) - Thành phần: - Thành phần: Khoai tây: 200 g Glucose: 20 g Agar: 20 g N−ớc cất: 1000 ml
- Ph−ơng pháp điều chế: chọn những củ khoai tây sạch không bị nhiễm bệnh, gọt vỏ và rửa sạch cân lấy 200g. Sau đó cắt thành lát mỏng cho vào nồi nhôm đ1 rửa sạch, tiếp đó cho 1000 ml n−ớc cất vào và cho lên bếp đun, cho sôi khoảng 30 phút. Lọc lấy phần n−ớc dịch khoai tây vào bình tam giác và cho thêm n−ớc cất vừa đủ 1000 ml , rồi bắc lên bếp đun tiếp tục. Khi dịch sôi lăn tăn thì cho 20g Glucose vào khuấy cho tan, sau đó cho từ từ 20g Agar (vừa cho vừa khuấy đều để Agar tan hết). Đổ ra bình tam giác, bịt kín miệng bình bằng giấy bạc, hấp khử trùng ở 1210C (1.5 atm) trong khoảng 30-45 phút, hấp xong để nguội đến 550C rồi đổ vào đĩa petri, có thể bảo quản môi tr−ờng trong tủ lạnh.
- Môi tr−ờng PGA là môi tr−ờng giàu dinh d−ỡng, dùng để cấy truyền đỉnh sinh tr−ờng và nghiên cứu khả năng sinh tr−ởng của nấm.
3.1.3.3. Môi tr−ờng khoai tây – carốt – agar (PCA)
- Thành phần:
Khoai tây: 200 g Cà rốt: 200 g Agar: 20 g
N−ớc cất: 1000 ml
- Ph−ơng pháp điều chế: chọn khoai tây, cà rốt không bị bệnh, ch−a mọc mầm, rửa sạch, gọt vỏ và cân mỗi loại 200g, thái mỏng thành từng miếng cho vào 1000 ml nớc rồi đun sôị Lọc lấy dịch vào bình tam giác và cho thêm
n−ớc cất vừa đủ 1000 ml. Tiếp tục đun sôi dịch vừa lọc đ−ợc, rồi cho từ từ 20g Agar (vừa cho vừa khuấy đều để cho Agar tan hết). Đổ ra bình tam giác, bịt kín miệng bình bằng giấy bạc, hấp khử trùng ở 1210C (1.5atm) trong khoảng 30 - 45 phút, hấp xong để nguội đến khoảng 550C rồi đổ ra đĩa petrị
- Môi tr−ờng PCA là môi tr−ờng giàu dinh d−ỡng, dùng để cấy truyền đỉnh sinh tr−ởng và nghiên cứu khả năng sinh tr−ởng của nấm.
3.1.3.4. Môi tr−ờng cà rốt – agar (CA)
- Thành phần:
Cà rốt: 200 g Agar: 20 g
N−ớc cất: 1000 ml
- Ph−ơng pháp điều chế: chọn cà rốt sạch bệnh, ch−a mọc mầm, rửa và gọt sạch vỏ và cân, thái miếng mỏng, cho đun sôị Lọc lấy dịch vào bình tam giác và cho thêm n−ớc cất vừa đủ 1000 ml. Tiếp tục đun sôi dịch cà rốt, cho từ từ Agar vào ( vừa cho vừa khuấy đều để Agar tan hết). Đổ ra bình tam giác, bịt kín miệng bình bằng giấy bạc, hấp ở nhiệt độ 1210C (1.5 atm) trong khoảng 30 - 45 phút, hấp xong để nguội đến 550C rồi đổ vào đĩa petrị
- Môi tr−ờng CA nghèo dinh d−ỡng so với môi tr−ờng PGA và môi tr−ờng PCA, nh−ng lại giàu dinh d−ỡng hơn môi tr−ờng WẠ Vì vậy nó đ−ợc dùng trong nghiên cứu khả năng sinh tr−ởng của nấm.
3.1.4. Thời gian và địa điểm thực tập (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Thời gian từ ngày 10/ 01/ 2008 đến 30/ 06/ 2008. - Địa điểm thực tập:
+ Hà Nội
+ Phòng thí nghiệm thực tập Bộ môn Bệnh cây - Khoa Nông học Tr−ờng ĐHNN- Hà Nộị
3.3. Nội dung nghiên cứu
- Tiến hành điều tra, thu thập mẫu bệnh lở cổ rễ trên đồng ruộng, xác định mức độ phổ biến và mức độ gây hại của bệnh trên các cây trồng cạn vụ xuân hè 2008 tại Hà Nộị
- Tìm hiểu đặc điểm hình thái, sinh học, và xác định phạm vi ký chủ của nấm của nấm Rhizoctonia solani Kuhn.
- Khảo sát khả năng phòng trừ nấm Rhizoctonia solani Kuhn bằng nấm đối kháng Trichoderma viride và bằng một số thuốc hoá học trên môi tr−ờng nhân tạo, trong điều kiện chậu vạị
3.4. Ph−ơng pháp nghiên cứu
3.4.1. Ph−ơng pháp điều tra, nghiên cứu ngoài đồng ruộng
Chúng tôi tiến hành điều tra, thu thập mẫu bệnh theo ph−ơng pháp của Viện bảo vệ Thực vật (1997)[21]. Điều tra theo 5 điểm hình chéo góc, sau đó xác định tỷ lệ bệnh. Điều tra chọn mẫu ruộng ngẫu nhiên theo ph−ơng pháp tịnh tiến, thu thập mẫu bệnh ở các vùng khác nhau của Hà Nộị
3.4.2. Ph−ơng pháp phân lập, nghiên cứu nấm Rhizoctonia solani Kuhn
3.4.2.1. Phân lập và giám định nấm Rhizoctonia solani Kuhn - Ph−ơng pháp phân lập nấm Rhizoctonia solani Kuhn - Ph−ơng pháp phân lập nấm Rhizoctonia solani Kuhn
Sau khi thu thập mẫu điển hình từ đồng ruộng, chúng tôi tiến hành rửa sạch mẫu bệnh, sau đó rửa lại bằng n−ớc cất vô trùng, làm khô bằng giấy thấm vô trùng. Cắt mô bệnh ở phần giáp ranh giữa mô bệnh và mô khỏe đ−ờng kính 1-2 mm, khử trùng bằng cồn 700 trong khoảng 5-10 giây, thấm khô bằng giấy thấm vô trùng. Sau đó dùng que cấy đ1 khử trùng cấy mô bệnh vào môi tr−ờng WA để ở điều kiện nhiệt độ khoảng 25-300C. Sau khi sợi nấm mọc cách mô bệnh 1-2 cm, tiến hành kiểm tra d−ới kính hiển vi để xác định nấm gây bệnh và cấy truyền sang môi tr−ờng PGA khoảng 2-3 lần để tạo nấm thuần và giữ nguồn.
- Ph−ơng pháp giám định nấm Rhizoctonia solani Kuhn: theo Khetmalas. M.B et al (1984)[33]
3.4.2.2. Kỹ thuật cấy truyền nấm
Chọn đĩa petri có nguồn nấm, tiến hành khử trùng đột (đ−ờng kính đột: 5 mm) và que cấy bằng cồn 700 trên ngọn lửa đèn cồn. Dùng đột đ1 khử trùng cắt phần đầu đỉnh sinh tr−ởng của sợi nấm, sau đó dùng que cấy đ1 khử trùng lấy phần vừa đột đặt chính giữa vào hộp lồng petri đ1 đổ môi tr−ờng. Cấy thuần nhằm tạo nguồn nấm thuần để tiến hành các thí nghiệm trong phòng và tạo nguồn nấm bệnh cho thí nghiệm nhà l−ớị
3.4.2.3. Nghiên cứu đặc hình thái của nấm Rhizoctonia solani Kuhn Tiến hành nuôi các isolates của nấm Rhizoctonia solani Kuhn trên môi Tiến hành nuôi các isolates của nấm Rhizoctonia solani Kuhn trên môi tr−ờng nhân tạo ở cùng một ng−ỡng nhiệt độ, sau đó theo dõi sự hình thành tản nấm, sự biến đổi màu sắc tản nấm, đ−ờng kính tản nấm, thời gian hình thành hạch non, hạch già, màu sắc hạch già, hình dạng và cấu tạo sợi nấm.
3.4.2.4. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm Rhizoctonia solani Kuhn
+ Nghiên cứu ảnh h−ởng của nhiệt độ đến đến sự phát triển của các isolates nấm Rhizoctonia solani Kuhn trên môi tr−ờng PGẠ
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm ảnh h−ởng của nhiệt độ tới sự phát triển của các isolates nấm Rhizoctonia solani Kuhn sau khi đ1 phân lập nguồn nấm thuần trên môi trờng PGẠ Từ nguồn nấm thuần đó cấy truyền sang các đĩa petri đ1 chứa sẵn môi tr−ờng PGẠ Trên mỗi isolates tiến hành đặt ở 4 ng−ỡng nhiệt độ 200C, 250C, 300C và 350C, ở mỗi ng−ỡng nhiệt độ nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 1 đĩa petrị Thí nghiệm đ−ợc tiến hành trong cùng điều kiện, cùng thời điểm.
Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi và đo đ−ờng kính của tản nấm 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày sau cấỵ Đơn vị đo là mm.
+ Nghiên cứu ảnh h−ởng của môi tr−ờng nuôi cấy đến sự phát triển của các isolates nấm Rhizoctonia solani Kuhn.
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm ảnh h−ởng của môi tr−ờng nuôi cấy đến sự phát triển của các isolates nấm Rhizoctonia solani Kuhn sau khi đ1 phân lập nguồn nấm thuần trên môi tr−ờng PGẠ Từ nguồn nấm thuần trên mỗi isolates đó tiến hành cấy truyền sang 4 môi tr−ờng PGA, PCA, CA, WA ở điều kiện nhiệt độ phòng, mỗi môi tr−ờng nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại là 1 đĩa petrị Thí nghiệm đ−ợc tiến hành trên cùng điều kiện, cùng thời điểm.
Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi và đo đ−ờng kính của tản nấm 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày sau cấy (đơn vị đo là mm).
+ Nghiên cứu ảnh h−ởng của pH môi tr−ờng đến sự phát triển của nấm
Rhizoctonia solani Kuhn
Cách pha môi tr−ờng pH: môi tr−ờng PGA tr−ớc khi đem hấp khử trùng dùng giấy quỳ để đo pH, sau đó dùng NaOH hoặc HCl để điều chỉnh pH. Sau khi có đ−ợc các môi tr−ờng pH cần cho thí nghiệm (pH5, pH6, pH7, pH8) đem hấp khử trùng ở 1210C (1,5atm) trong 30 phút.
Mỗi công thức pH nhắc lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa petri
Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi sự phát triển của tản nấm và đo đ−ờng kính tản nấm sau các ngày nuôi cấỵ Đơn vị là mm.
3.4.3. Nghiên cứu phạm vi ký chủ của nấm Rhizoctonia solani Kuhn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chúng tôi tiến hành thu thập và phân lập thuần các isolates nấm
Rhizoctonia solani Kuhn từ các nguồn bệnh trên các cây ký chủ khác nhau là: đậu xanh, cà chua, d−a chuột, đậu đũa, vv. Sau đó lấy các isolates nấm
Rhizoctonia solani Kuhn đ1 đ−ợc phân lập và làm thuần ở trên lần lợt lây nhiễm chéo cho nhau bằng ph−ơng pháp xử lý hạt giống. Đối với mỗi isolates nấm Rhizoctonia solani Kuhn tiến hành trên một loại hạt giống đ−ợc nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại là một chậu vại, số l−ợng hạt giống đ−ợc xử lý và gieo trong mỗi chậu vại tùy thuộc vào từng giống cây trồng. Đất trong chậu vại đ−ợc hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, trong 3 giờ.
Th−ờng xuyên theo dõi, xác định số cây sống sau khi lây nhiễm để từ đó xác định TLB(%).
3.4.4. Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo trong nhà l−ới
Lây bệnh nhân tạo nấm Rhizoctonia solani nguồn phân lập từ đậu xanh, cà chua, d−a chuột, vv lên chính các cây trồng đó để xác định nguyên nhân gây bệnh và thời kỳ tiềm dục của bệnh.
Mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại là 30 cây (mỗi công thức thí nghiệm 90 cây). Tiến hành lây nhiễm nhân tạo ở giai đoạn cây con đối với tất cả các cây làm thí nghiệm.
Cách lây nhiễm: Chọn đĩa nấm Rhizoctonia solani thuần, sinh tr−ởng tốt hòa với 30ml n−ớc cất. T−ới dung dịch nấm Rhizoctonia solani vào gốc cây cần lây nhiễm. Dùng 2 đĩa nấm Rhizoctonia solani lây nhiễm cho 90 cây ở mỗi công thức thí nghiệm.
Chỉ tiêu theo dõi: Tính mức độ nhiễm bệnh (TLB%) và xác định thời kỳ tiềm dục của bệnh (ngày).
3.4.5. Khảo sát khả năng phòng trừ nấm Rhizoctonia solani Kuhn
bằng nấm đối kháng Trichoderma viride trên môi tr−ờng nhân tạo và trong chậu vại
3.4.5.1. Khảo sát khả năng phòng trừ nấm Rhizoctonia solani Kuhn
bằng nấm đối kháng Trichoderma viride trên môi tr−ờng PGA
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm gồm 4 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 1 đĩa petrị
- Công thức 1 : Cấy riêng rẽ nấm Rhizoctonia solani Kuhn và nấm
Trichoderma viride.
- Công thức 2: Cấy nấm Rhizoctonia solani vào petri tr−ớc, sau 24h thì cấy nấm Trichoderma viride vàọ
- Công thức 3: Cấy nấm Rhizoctonia solani và nấm Trichoderma viride
- Công thức 4: Cấy nấm Trichoderma viride vào petri tr−ớc, sau 24h thì cấy nấm Rhizoctonia solani.
Ph−ơng pháp cấy: Dùng đột (đ−ờng kính 5 mm) đ1 khử trùng đột lấy phần đỉnh sinh tr−ởng của tản nấm trên nguồn nấm thuần, sau đó tiến hành cấy truyền.
Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi đặc điểm hình thái và đo đ−ờng kính tản nấm của nấm Rhizoctonia solani Kuhn và nấm Trichoderma viride (đơn vị đo là mm).
3.4.5.2. Khảo sát khả năng phòng trừ nấm Rhizoctonia solani Kuhn
bằng nấm đối kháng Trichoderma viride trong chậu vại
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm gồm 4 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần.
- Công thức 1: Ngâm hạt giống trong dung dịch nấm Rhizoctonia solani
Kuhn trong 10 phút, sau đó đem gieọ
- Công thức 2: Ngâm hạt giống trong dung dịch Rhizoctonia solani
Kuhn, sau đó đem gieo khi có lá mâm thì xử lý bằng Trichoderma viride. - Công thức 3: Ngâm hạt giống trong hỗn hợp dung dịch nấm Rhizoctonia solani Kuhn và Trichoderma viride trong 10 phút, sau đó đem gieọ
- Công thức 4: Ngâm hạt giống trong dung dịch Trichoderma viride trong 10 phút sau đó đem gieo, khi có lá mầm thì xử lý bằng Rhizoctonia solani Kuhn.
Chỉ tiêu theo dõi: Xác định tỷ lệ nảy mầm (%), tỷ lệ cây chết (%) ở từng công thức. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.4.5.3. Khảo sát hiệu lực phòng trừ nấm Rhizoctonia solani Kuhn bằng một số thuốc hoá học trên môi tr−ờng nhân tạo một số thuốc hoá học trên môi tr−ờng nhân tạo
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm 4 nồng độ khác nhau của từng thuốc với các mẫu phân lập từ các cây : cà chua, đậu đũa, d−a chuột.
Rovral 50 WP : nồng độ : 0.1%; 0.2%; 0.25%. Validacin 3 Đ : 0.1%; 0.2%; 0.25%
3.5. Ph−ơng pháp tính toán và sử lý số liệu - Tính tỷ lệ bệnh (%): - Tính tỷ lệ bệnh (%): 100 (%)= ì B A TLB A: Số cây bị bệnh B: Tổng số cây điều tra
- Hiệu lực đối kháng (HLĐK) của nấm Trichoderma viride với nấm
Rhizoctonia solani theo công thức Abbott C - T
HLĐK (%) = x 100 C
Trong đó: c: là đ−ờng kính tản nấm ở công thức đối chứng
t: là đ−ờng kính tản nấm ở các công thức có xử lý
Trichoderma viride
- Hiệu lực phòng trừ (HLPT) của nấm Trichoderma viride với nấm
Rhizoctonia solani theo công thức Abbott: C - T
HLPT (%) = x 100 C
Trong đó c: số cây chết ở công thức đối chứng, t: số cây chết ở công thức có xử lý Trichoderma viridẹ
- Số liệu đ−ợc xử lý thống kê bằng EXCEL, ch−ơng trình Anova
- Các giá trị trung bình của nghiệm thức đ−ợc so sánh bằng F, t, LSD, Duncan với P = 0.05.
4. Kết quả nghiên cứu và thảo luận
4.1. Mức độ nhiễm bệnh lở cổ rễ trên một số cây trồng cạn vụ xuân hè tại Hà Nội năm 2008 hè tại Hà Nội năm 2008
4.1.1. Nhận biết triệu chứng bệnh lở cổ rễ ngoài đồng ruộng
Bệnh lở cổ rễ do nấm Rhizoctonia solani gây rạ Bệnh gây hại trên rất nhiều họ cây trồng cạn nh−: họ bầu bí, họ đậu đỗ, vv và gây hại trong suốt thời gian sinh tr−ởng của cây trồng nhất là ở giai đoạn cây con.
Nấm Rhizoctonia solani có thể xâm nhiễm vào hạt giống ở giai đoạn tr−ớc hoặc sau khi nảy mầm, gây hại hạt giống, nấm th−ờng tạo vết loét trên trụ mầm. Trên trụ mầm, vết bệnh th−ờng có màu đỏ, lõm sâụ Thân mầm bị nhiễm bệnh th−ờng có những đốm màu nâu sẫm và phát triển xuống bộ rễ làm cây con chết.[27]
ở giai đoạn cây con phần rễ, cổ rễ và phần gốc thân sát mặt đất bị thâm đen, thối mục, cây héo chết đổ gục trên ruộng. Khi mới xuất hiện vết bệnh là rất nhỏ màu đen ở gốc thân, cổ rễ sau lan rộng ra rất nhanh bao quanh toàn bộ rễ và gốc thân. Về sau vết bệnh biến thành màu nâu, phần gốc thân hơi tóp lại lở loét. Nếu bệnh hại nặng cây sẽ ng1 gục trên ruộng. Trên cây bị bệnh, lá trên thân vẫn giữ đ−ợc màu xanh vài ngày, sau đó toàn bộ thân cây bị héo rũ đổ gục xuống, gây chết hàng loạt hoặc rải rác từng mảng trong ruộng. Trên