Vì tính chất đặc trưng mang điện tích dương nên chitosan có thể tương tác với phần lớn các chất hữu cơ mang điện tích âm. Chitosan thể hiện là một chất keo tụ, tạo bông tốt, có hiệu quả trong việc thu hồi các chất hữu cơ trong nước, đặc biệt là protein. Phân tử chitosan cũng có khả năng hấp phụ, tạo cầu nối để liên kết các hạt keo protein đã kết tủa thành các phân tử có kích thước lớn hơn và lắng. Ngoài ra, chitosan có độ deacetyl cao thì trong dung dịch có chứa nhiều gốc amin tích điện dương sẽ trung hòa điện tích của các phân tử protein tích điện âm trong dung dịch nước rửa, giảm khả năng hydrat hóa, tập hợp lại và kết tụ [14]. Nồng độ chitosan cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu quả thu hồi, cần sử dụng chitosan ở một nồng độ hợp lý vì khi tăng nồng độ chitosan làm tăng số điện tích cùng dấu và đẩy nhau tạo nên một mạng lưới keo cản trở quá trình keo tụ lắng xuống của các phân tử protein. Chitosan có độ deacetyl hóa càng cao thì các nhóm tích điện dương trên mạch chitosan càng nhiều, thuận lợi trong tương tác ion để thu hồi protein hòa tan.
Ưu điểm của phương pháp này là không gây biến tính protein, không độc hại và hiệu quả thu nhận cao. Do đó phương pháp này áp dụng để tận thu các chế phẩm enzyme và các hợp chất có hoạt tính sinh học khác.
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng
2.1.1. Đầu tôm thẻ chân trắng
Đầu tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei hoặc Penaeus vannamei) được thu nhận công ty cổ phần Nha Trang seafood (F17). Chất lượng đầu tôm tươi, không bị biến đổi màu sắc như đen đầu hay đỏ đầu, không bẩn nhiễm rác và tạp chất, được lưu giữ lạnh bằng thùng xốp cách nhiệt (<50C) với đá khô khi đưa về phòng thí nghiệm. Phế liệu tôm trước khi sử dụng được rửa sạch, để ráo. Trong trường hợp chưa thí nghiệm ngay thì bao gói bảo quản đông trong điều kiện nhiệt độ - 200C.
Lưu ý: Chỉ sử dụng đầu tôm và không sử dụng vỏ tôm vì hàm lượng caroten- protein trong vỏ thấp.
2.1.2. Các hóa chất, máy móc và dụng cụ sử dụng phân tích trong đề tài
*Cụ thể hóa chất, máy móc và dụng cụ sẽ được trình bày rõ ở phần Phụ lục
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Thu mẫu và xử lý: Phế liệu tôm thẻ chân trắng phải đảm bảo độ tươi, không
hư hỏng được thu nhận đem về phòng thí nghiệm và được duy trì ở nhiệt độ lạnh, sau đó loại bỏ rác bẩn, rửa sạch tạp chất và để ráo nước. Để đảm bảo sự đồng nhất của nguyên liệu trong quá trình nghiên cứu, phế liệu tôm tươi được thu mỗi đợt 10 kg, sau khi xử lý loại bỏ tạp chất và để ráo, cân thành những lượng nhỏ đảm bảo một lần lấy mẫu làm thí nghiệm, tiến hành thí nghiệm ngay hoặc trữ đông ở -20OC cho đến khi sử dụng, thời gian bảo quản tối đa là 1 tháng.
2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Đầu tôm Đầu tôm
Đánh giá hiệu quả thu hồi, xác định hàm lượng astaxanthin
Đề xuất quy trình tách chiết hỗn hợp caroten-protein hiệu quả Xác định nồng độ acid lactic bổ sung và thời gian xử lý
Xử lý sơ bộ Đầu tôm
Sản xuất chitin-chitosan
Phần bã Phần riêng
Phần dịch thủy phân
Thu hồi hỗn hợp caroten-protein
Thuyết minh sơ đồ:
Đầu tôm thẻ chân trắng sau khi rửa và loại bỏ tạp chất, đế ráo nước, cân mỗi
mẫu thí nghiệm 100g đồng thời bổ sung thêm 100ml nước theo tỷ lệ 1:1, sau đó nghiền mẫu với kích thước 2-3 mm để tăng diện tích tiếp xúc với enzyme nội tại của đầu tôm trong quá trình thủy phân.
Hỗn hợp caroten-protein được tách chiết ra khỏi đầu tôm bằng phương pháp thủy phân dung kết hợp acid lactic và Flavourzyme. Việc lựa chọn acid lactic và Flavourzyme này dựa vào nghiên cứu hiệu quả thủy phân phế liệu tôm theo kết quả của Trang Sĩ Trung [13] và Phạm Thị Đan Phượng [10]. Thứ tự xử lý acid lactic trước làm nền tảng cho quá trình thủy phân diễn ra mạnh mẽ hơn khi bổ sung Flavourzyme giai đoạn sau (ở nhiệt độ tối thích của enzyme này là 55OC). Sau đó cho mẫu vào hệ thống có nhiệt độ 70OC trong 15 phút để bất hoạt enzyme rồi làm nguội.
Tiến hành ép (lọc) để tách riêng phần dịch và phần bã. Phần bã được rửa bằng nước ấm, nước rửa được thu hồi cùng với phần dịch. Phần bã được đưa sang công đoạn sản xuất chitin, chitosan còn phần dịch được tiếp tục thu hồi chế phẩm caroten-protein.
Các yếu tố như nồng độ, thời gian xử lý acid lactic tối ưu và tỷ lệ, thời gian xử lý Flavourzyme tối ưu của quá trình thủy phân được xác định thông qua hiệu suất thu hồi chế phẩm caroten-protein và hàm lượng astaxanthin.
Quá trình thu hồi caroten-protein được thực hiện bằng phương pháp kết hợp giữa kết tủa protein bằng phương pháp điểm đẳng điện và xử lý nhiệt, đồng thời có thể bất hoạt được enzyme để kết thúc quá trình thủy phân, ngoài ra trong quá trình này có sử dụng chitosan đóng vai trò là chất tạo tủa và keo tụ để tăng hiệu quả quá trình kết tủa protein dựa theo nghiên cứu của Trang Sĩ Trung [13]. Cụ thể: dịch thủy phân chứa caroten-protein được điều chỉnh pH về pH 4,3-4,5 bằng HCl 10% để kết tủa protein, gia nhiệt 70OC/10 phút, bổ sung chitosan ở nồng độ 100 ppm, sau cùng để lắng qua đêm ở 4OC.
Sau đó ly tâm bằng máy ly tâm thể tích lớn trong 15 phút với tốc độ 3500 vòng. Thu hồi hỗn hợp caroten-protein và đánh giá hiệu suất thu hồi, hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp.
2.2.2. Xác định nồng độ acid lactic
Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ acid lactic (v/w) thích hợp để thu hồi hỗn hợp caroten-protein đạt hiệu quả cao.
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ acid lactic
Thuyết minh quy trình: Đầu tôm thẻ chân trắng được rửa sạch, loại bỏ tạp
chất, để ráo. Cân 100g mẫu cho vào cốc 250 ml rồi cho vào 100ml nước theo tỷ lệ 1:1, trộn đều nghiền mẫu với kích thước 2-3mm để tạo điều kiện tiếp xúc với cơ chất.
Xử lý bằng acid lactic với các nồng độ khác nhau (v/w), trong 2 giờ và ở nhiệt độ phòng
Xử lý bằng Flavourzyme (tỷ lệ enzyme/ đầu tôm là 0,2% (w/w), ở nhiệt độ
55OC trong 2 giờ) [14]
Thu hồi hỗn hợp caroten-protein
Đánh giá hiệu suất thu hồi hỗn hợp caroten-protein và xác định hàm lượng astaxanthin
0% 0,1% 0,2% 0,3% 0,4% 0,5% 0,6% 0,7%
Xử lý sơ bộ Đầu tôm
Bổ sung acid lactic vào mẫu với nồng độ acid lactic (v/w) khác nhau: 0%; 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4%; 0,5%; 0,6%; 0,7% xử lý trong 2h ở điều kiện nhiêt độ thường, tiếp tục bổ sung Flavourzyme/đầu tôm với tỷ lệ là 0,2% (w/w), sau đó tiến hành ủ ở 55OC cho đến 2h. Tiếp theo cho mẫu vào trong hệ thống có nhiệt độ 70OC trong 15 phút để bất hoạt enzyme rồi làm nguội. Tiến hành ép (lọc) để tách riêng phần dịch và phần bã. Thu hồi caroten-protein từ phần dịch bằng cách kết hợp cả ba phương pháp (điều chỉnh pH 4,3 - 4,5; gia nhiệt 70OC/10 phút và bổ sung chitosan 100ppm), để lắng qua đêm ở 4OC. Sau đó ly tâm bằng máy ly tâm thể tích lớn trong 15 phút với tốc độ 3500 vòng [14].
Xác định hiệu suất thu hồi và hàm lượng astaxanthin có trong hỗn hợp caroten-protein và từ đó chọn ra nồng độ acid lactic thích hợp.
Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thu hồi, hàm lượng astaxanthin.
Kết quả mong đợi: Chọn nồng độ acid lactic để đạt hiệu suất thu hồi cao và chất lượng hỗn hợp caroten-protein thích hợp.
2.2.3. Xác định thời gian xử lý acid lactic
Mục đích thí nghiệm: Xác định thời gian thích hợp cho công đoạn thủy phân
trong quá trình thu hồi caroten-protenin đạt hiệu quả cao nhất. Thuyết minh quy trình:
Đầu tôm thẻ chân trắng được rửa sạch, loại bỏ tạp chất, để ráo. Cân 100g mẫu cho vào cốc 250 ml rồi cho vào 100ml nước theo tỷ lệ 1:1, trộn đều nghiền mẫu với kích thước 2-3mm để tạo điều kiện tiếp xúc với cơ chất.
Bổ sung acid lactic vào mẫu với nồng độ acid lactic (v/w) được xác định ở thí nghiệm 2.2.2 vào các mẫu để xử lý theo thời gian khác nhau như sau: 0h; 1h; 2h; 3h; 4h; 5h ở nhiệt độ thường. Tiếp theo, bổ sung Flavourzyme/đầu tôm (w/w) với tỷ lệ 0,2% vào bình đựng mẫu và sau đó tiến hành ủ ở 55OC cho đến 2h. Sau đó cho mẫu vào trong hệ thống có nhiệt độ 70OC trong 15 phút để bất hoạt enzyme rồi làm nguội. Tiến hành ép (lọc) để tách riêng phần dịch và phần bã. Thu hồi caroten- protein từ phần dịch bằng cách kết hợp cả ba phương pháp (điều chỉnh pH 4,3 - 4,5; gia nhiệt 70OC/10 phút và bổ sung chitosan 100ppm), để lắng qua đêm ở 4OC. Sau đó ly tâm bằng máy ly tâm thể tích lớn trong 15 phút với tốc độ 3500 vòng [14].
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian xử lý acid lactic
Xác định hiệu suất thu hồi và hàm lượng astaxanthin có trong hỗn hợp caroten-protein và từ đó chọn ra thời gian xử lý acid lactic thích hợp.
Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thu hồi, hàm lượng astaxanthin.
Kết quả mong đợi: Chọn thời gian xử lý acid lactic thích hợp để đạt hiệu suất thu hồi cao và chất lượng hỗn hợp caroten-protein cao nhất.
2.2.4. Xác định tỷ lệ Flavourzyme/đầu tôm
Mục đích thí nghiệm: Xác định tỷ lệ Flavourzyme/đầu tôm (w/w) thích hợp
để thu hồi hỗn hợp caroten-protein đạt hiệu quả cao.
0h 1h 2h 3h 4h 5h
Thu hồi hỗn hợp caroten-protein
Đánh giá hiệu suất thu hồi hỗn hợp caroten-protein và xác định hàm lượng astaxanthin
Chọn thời gian xử lý thích hợp Xử lý sơ bộ
Xử lý bằng acid lactic được xác định ở thí nghiệm 2.2.2 ở nhiệt độ phòng trong các khoảng thời gian khác nhau
Xử lý bằng Flavourzyme (tỷ lệ enzyme/ đầu tôm 0,2% (w/w), ở nhiệt độ 55OC trong 2 giờ) [14]
55oC) Đầu tôm
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ Flavourzyme/đầu tôm Thuyết minh quy trình:
Đầu tôm thẻ chân trắng được rửa sạch, loại bỏ tạp chất, để ráo. Cân 100g mẫu cho vào cốc 250 ml rồi cho vào 100ml nước theo tỷ lệ 1:1, trộn đều nghiền mẫu với kích thước 2-3mm để tạo điều kiện tiếp xúc với cơ chất.
Bổ sung acid lactic với nồng độ và thời gian xử lý lấy từ kết quả của thí nghiệm 2.2.2 và 2.2.3 ở nhiệt độ thường. Tiếp theo bổ sung Flavourzyme lần lượt với tỷ lệ enzyme/đầu tôm (w/w) là: 0%; 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4%; 0,5% vào bình đựng mẫu và tiến hành ủ ở 55OC cho đến 2h. Sau đó cho mẫu vào trong hệ thống có
0,1%
0% 0,2% 0,3% 0,4% 0,5%
Xử lý sơ bộ
Xử lý bằng acid lactic theo nồng độ thích hợp đã xác định ở thí nghiệm 2.2.2 và thời gian xử lý thích hợp theo thí nghiệm 2.2.3
Xử lý bằng Flavourzyme ở các tỷ lệ enzyme/đầu tôm (w/w) khác nhau ở nhiệt độ 55OC trong 2 giờ) [14]
Thu hồi hỗn hợp caroten-protein
Đánh giá hiệu suất thu hồi hỗn hợp caroten-protein và xác định hàm lượng astaxanthin
Chọn tỷ lệ Flavourzyme thích hợp Đầu tôm
nhiệt độ 70OC trong 15 phút để bất hoạt enzyme rồi làm nguội. Tiến hành ép (lọc) để tách riêng phần dịch và phần bã. Thu hồi caroten-protein từ phần dịch bằng cách kết hợp cả ba phương pháp (điều chỉnh pH 4,3 - 4,5; gia nhiệt 70OC/10 phút và bổ sung chitosan 100ppm), để lắng qua đêm ở 4OC. Sau đó ly tâm bằng máy ly tâm thể tích lớn trong 15 phút với tốc độ 3500 vòng [14].
Xác định hiệu suất thu hồi và hàm lượng astaxanthin có trong hỗn hợp caroten-protein và từ đó chọn ra thời gian xử lý acid lactic thích hợp.
Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thu hồi, hàm lượng astaxanthin.
Kết quả mong đợi: Chọn tỷ lệ Flavourzyme so với nguyên liệu thích hợp để đạt hiệu suất thu hồi cao và chất lượng hỗn hợp caroten-protein tốt nhất.
2.2.5. Xác định thời gian xử lý Flavourzyme
Mục đích thí nghiệm: Xác định thời gian xử lý enzyme thích hợp để thu hồi
hỗn hợp caroten-protein đạt hiệu quả cao.
Thuyết minh quy trình:
Đầu tôm thẻ chân trắng được rửa sạch, loại bỏ tạp chất, để ráo. Cân 100g mẫu cho vào cốc 250 ml rồi cho vào 100ml nước theo tỷ lệ 1:1, trộn đều nghiền mẫu với kích thước 2-3mm để tạo điều kiện tiếp xúc với cơ chất.
Bổ sung acid lactic với nồng độ và thời gian xử lý lấy từ kết quả của thí nghiệm 2.2.2 và 2.2.3 ở nhiệt độ thường. Tiếp theo bổ sung Flavourzyme theo tỷ lệ enzyme/đầu tôm được xác định ở thí nghiệm 2.2.4 và ủ ở nhiệt độ 55OC với thời gian xử lý khác nhau là: 0h; 1h; 2h; 3h; 4h; 5h. Sau đó cho mẫu vào trong hệ thống có nhiệt độ 70OC trong 15 phút để bất hoạt enzyme rồi làm nguội. Tiến hành ép (lọc) để tách riêng phần dịch và phần bã. Thu hồi caroten-protein từ phần dịch bằng cách kết hợp cả ba phương pháp (điều chỉnh pH 4,3 - 4,5; gia nhiệt 70OC/10 phút và bổ sung chitosan 100ppm), để lắng qua đêm ở 4OC. Sau đó ly tâm bằng máy ly tâm thể tích lớn trong 15 phút với tốc độ 3500 vòng [14].
Xác định hiệu suất thu hồi và hàm lượng carotenoid có trong hỗn hợp caroten-protein và từ đó chọn ra thời gian xử lý acid lactic thích hợp.
Kết quả mong muốn: Chọn thời gian xử lý Flavourzyme thích hợp để đạt hiệu suất thu hồi cao và chất lượng hỗn hợp caroten-protein tốt nhất.
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian xử lý Flavourzyme
0h 1h 2h 4h 5h
Thu hồi hỗn hợp caroten-protein
Đánh giá hiệu suất thu hồi hỗn hợp caroten-protein và xác định hàm lượng astaxanthin
Chọn thời gian xử lý Flavourzyme thích hợp Đầu tôm
Xử lý sơ bộ
Xử lý bằng acid lactic theo nồng độ thích hợp đã xác định ở thí nghiệm 2.2.2 và thời gian xử lý thích hợp theo thí nghiệm 2.2.3
Xử lý bằng Flavourzyme theo tỷ lệ đã xác định ở thí nghiệm 2.2.4, nhiệt độ 55OC với thời gian xử lý khác nhau [14]
2.3. Các phương pháp phân tích và kiểm tra
1. Độ ẩm, hàm lượng khoáng được phân tích theo phương pháp chuẩn của AOAC.
2. Xác định hàm lượng astaxanthin tổng số bằng phương pháp quang phổ. 3. Hiệu suất thu hồi chế phẩm được tính theo phương pháp của Dauphin cụ thể: Hiệu suất thu hồi hỗn hợp caroten-protein (%) = (M*100)/M0; M: Khối lượng hỗn hợp caroten-protein thu được (g); M0: Khối lượng nguyên liệu (g).
2.4. Phương pháp phân tích số liệu
Số liệu báo cáo là trung bình của 3 lần phân tích. Kết quả được xử lý bằng phần mền Excel và sử dụng phần mềm sử lý số liệu SPSS 16.0. Giá trị của p < 0,05 được xem là có ý nghĩa về mặt thống kê.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thành phần hóa học cơ bản của nguyên liệu đầu tôm
Phân tích thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm thẻ chân trắng như protein hay hàm lượng carotenoid là cần thiết để có thể xem xét có nên tiến hành thu hồi hỗn hợp caroten-protein. Điều này giúp nghiên cứu được thực hiện hiệu quả tránh mất thời gian tập trung vào nguồn nguyên liệu có giá trị thấp.
Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm thẻ chân trắng được phân tích và kết quả được trình bày ở Bảng 3.1
Bảng 3.1. Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm thẻ chân trắng
Chỉ tiêu phân tích Hàm lượng*
Protein (%) 50,7 ± 3,2
Khoáng (%) 27,1 ± 2,5
Lipid (%) 9,8 ± 2,7
Chitin (%) 11,3 ± 2,2
Astaxanthin (mg/kg) 166,4 ± 23,5
*Kết quảtính theo hàm lượng chất khô tuyệt đối.
Đầu tôm chứa 4 thành phần chính là protein, khoáng, lipid và chitin trong đó protein chiếm hàm lượng lớn nhất, khoảng 50%. Ngoài ra, trong đầu tôm còn có