Kiểm tra lại tính chất bias của chip sau khi đã đƣợc chức nang hóa bề mặt. Sử dụng hệ đo probe station, chọn chế độ đo đặc trƣng I-VDS phụ thuộc vào từng giá trị VBG với các thông số đƣợc thiết đặt nhƣ sau:
- Điện thế VDS đƣợc quét từ -2 V đến 2 V với bƣớc nhảy là 0.05 V. - Điện thế cổng VBG có giá trị từ -5 V đến 5 V với bƣớc nhảy 1 V.
Hình 4.2: Đặc trưng I-V của sợi Si với các giá trị khác nhau của VBG
Kết quả cho thấy vùng làm việc tốt nhất của chip nằm trong khoảng từ 1.7 V đến 1.8 V và điện thế VBG là -4 V.
Sử dụng chip vừa kiểm tra để phát hiện chất chỉ AFP trong dung dịch 1X PBS (pH 7.4). Dùng hệ đo probe station, chọn chế độ đo dòng điện theo thời gian với VDS
và VBG đƣợc thiết đặt theo thông số trên.
Trƣớc tiên cho chip vào đo dòng điện I theo thời gian t khi không có dung dịch PBS. Sau một khoảng thời gian là 200 giây, nhỏ dung dịch 1X PBS với pH = 7.4 vào. Sau 300 giây (tới giây thứ 500) bắt đầu cho dung dịch AFP nồng độ 500 ng/ml vào.
Các kết quả đo đƣợc trình bày trong các phần dƣới đây:
Đồ thị trong hình 4.3 thể hiện sự phụ thuộc của dòng điện theo thời gian, với thời gian đo là 1400 s. Trong khoảng 200 s đầu tiên, cƣờng độ dòng điện chạy qua sợi không thay đổi, nằm trong khoảng 3.4 đến 3.42 µA. Khi chúng ta bơm dung dịch 1X PBS vào sau thời điểm đó, dòng điện tăng lên đáng kể lên đến giá trị khoảng 3.5 µA. Sự tăng vọt này là do sự tƣơng tác của ion mang điện trong dung dịch PBS với dây Si. Tới giây thứ 500, bơm dung dịch chứa AFP với nồng độ 500 ng/ml vào. Trong 300 giây kể từ lúc bơm dung dịch, cƣờng độ dòng điện qua sợi vẫn không đổi và dao động trong khoảng 3.5 µA. Tuy nhiên bắt đầu từ giây thứ 800, cƣờng độ dòng điện tăng dần, điều này đƣợc giải thích là vì tới thời điểm này AFP mới bắt đầu bắt cặp với các kháng
thể đơn dòng của nó. Và thời gian để chúng bắt đầu bắt cặp với nhau là tƣơng đối giống với các kết quả trong các bài báo khoa học trƣớc đây. Quá trình bắt cặp diễn ra trong khoảng 300 giây, từ giây thứ 800 đến giây thứ 1100. Sau đó dòng điện không tăng nữa và trở nên ổn định hơn và dao động trong khoảng 3.53 µA kể từ giây thứ 1100.
Hình 4.3: Đồ thị I-t biểu thị sự bắt cặp của thụ thể với AFP ở nồng độ 500 ng/ml
Nhƣ vậy, với kết quả trên ta có thể khẳng định chip sợi Si sau khi chức năng hóa bề mặt đã bắt thành công AFP. Bởi vì AFP có điểm đẳng điện pI = 5.48 đƣợc pha loãng trong dung dịch có pH = 7.4 và do đó dung dịch sẽ mang điện tích âm. Bên cạnh đó, FET Si là bán dẫn loại p nên khi các hạt tải mang điện tích âm trong dung dịch AFP bám trên bề mặt sẽ làm cho dòng điện trong dây Si tăng và điện trở của dây giảm. Sự chênh lệch về dòng điện khi đo chip trong PBS và trong dung dịch AFP là khoảng 0.05 µA.
Sau khi phân tích kết quả trên, tiếp tục tiến hành một thử nghiệm khác là đo chip trong dung dịch AFP với nồng độ nhỏ hơn 100 ng/ml. Lặp lại các bƣớc thực hiện tƣơng tự nhƣ đo chip trong AFP 500 ng/ml nhƣng bỏ qua bƣớc đo chip khi không có dung dịch. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
air chip
start binding
sign of binding period AFP solution
Hình 4.4: Đồ thị I-t biểu thị sự bắt cặp của thụ thể với AFP ở nồng độ 100 ng/ml
Khi chúng ta đo chip có chứa dung dịch 1X PBS dòng điện dao động trong khoảng 4.44 µA. Tới giây thứ 300, bơm dung dịch chứa AFP với nồng độ 100 ng/ml vào, kể từ lúc này cƣờng độ dòng đã có sự thay đổi nhẹ. Điều có thể là do sự đập nhả của các phân tử AFP lên sợi. Tuy nhiên tại giây thứ 550 cƣờng độ dòng điện bắt đầu tăng, sự tăng dòng ấy cũng diễn ra trong khoảng 300 giây tới giây thứ 850 thì dừng lại và dòng điện trở nên ổn định ở khoảng 4.46 µA.
Qua kết quả của hai thí nghiệm trên ta thấy thời gian bắt cặp của kháng thể đơn dòng AFP và AFP trong hai lần thử nghiệm khác nhau là gần tƣơng tự nhƣ nhau và dòng điện tăng khi có dung dịch AFP là đúng nhƣ trong lí thuyết. Điều này cho thấy sự thành công trong việc bắt chất chỉ thị AFP của chip sợi Si sau khi đã chức năng hóa bề mặt. Ngoài ra khi so sánh hai kết quả đo đƣợc ta thấy: Sự chênh lệch cƣờng độ dòng điện khi đo chip trong dung dịch PBS với trong dung dịch AFP 100 ng/ml khoảng 25 nA và với dung dịch AFP 500 ng/ml là khoảng 50 nA.
Hình 4.5: Đồ thị I-t biểu thị sự chênh lệch về dòng khi đo chip trong PBS pH 7.4 và trong dung dịchAFP ở nồng độ 100 ng/ml.
Hình 4.6: Đồ thị I-t biểu thị sự chênh lệch về dòng khi đo chip trong PBS pH 7.4 và trong dung dịch AFP ở nồng độ 500 ng/ml.
KẾT LUẬN – HƢỚNG PHÁT TRIỂN I. Kết luận
Về phƣơng pháp chế tạo:
Sử dụng chủ yếu hai kĩ thuật quang khắc và ăn mòn trong công nghệ micro, chúng tôi đã chế tạo đƣợc sợi Si với bề dày ở kích thƣớc nano, có thể kiểm soát đƣợc quy trình chế tạo bằng phƣơng pháp top down với những bƣớc ăn mòn màng mỏng đặc biệt là kỹ thuật ăn mòn dị hƣớng trên wafer SOI [100] kết hợp với các bƣớc quang khắc. Ngoài ra chúng tôi có thể tích hợp nhiều transistor hiệu ứng trƣờng sợi Si trong một chíp kích thƣớc 10x10mm và 10x15mm.
Kết quả từ việc đo tính chất điện cho thấy cảm biến có tính chất điện tốt, không có các sai hỏng, không xuất hiện các bẫy điện tử, tạo đƣợc tiếp xúc thuần trở tại các điện cực.
Về phƣơng pháp thụ động hóa bề mặt:
Tham khảo quy trình chức năng hóa bề mặt sợi Si mà các nhóm nghiên cứu khác trên thế giới đã tiến hành, nhóm nghiên cứu đã đƣa ra một qui trình chức năng hóa bề mặt sợi Si có lớp SiO2. Trong qui trình hoạt hóa bề mặt này chúng tôi đã sử dụng GPTS đƣợc sử dụng làm chất kết nối. Dựa trên kết quả những thí nghiệm thu đƣợc cho thấy về tổng thể qui trình đƣa ra tƣơng đối thành công. Tuy nhiên chúng tôi chƣa thể đánh giá mức độ hiệu quả của bƣớc chiếu UV do bƣớc này đã đƣợc thực hiện trên thiết bị tự chế và sau đó cũng không có thiết bị chuyên dụng (ví dụ nhƣ XPS) để đánh giá định lƣợng các mối liên kết tạo ra.
Ngoài ra, ở điều kiện hiện tại PTN CNNN chƣa có những thiết bị cần thiết để có thể tiến hành qui trình chức năng hóa bề mặt trên sợi Si trơ (không có lớp SiO2) nên chƣa thể đƣa ra sự so sánh giữa các phƣơng pháp cũng nhƣ đánh giá mức độ hiệu quả của toàn qui trình.
Về qui trình và kết quả đo đạc chip trong dung dịch PBS và AFP:
Đã xây dựng đƣợc qui trình đo đạc, sử dụng sợi Si để định tính và định lƣợng nồng độ của chất chỉ thị sinh học AFP trong dung dịch PBS.
Cảm biến sinh học sợi Si mà chúng tôi chế tạo ra đã thể hiện độ nhạy ở thang đo nA, phù hợp với quá trình đo đạc các đối tƣợng sinh học.
Để kiểm tra tính chính xác của kết quả đo, chúng tôi đã tiến hành đo trong dung dịch buffer dùng pha AFP và dung dịch AFP với các nồng độ AFP khác nhau, kết quả cho thấy có sự khác biệt rõ rệt về dòng điện trong sợi.
Tuy nhiên từ những kết quả thu đƣợc, chúng tôi vẫn nhận thấy kết quả đo đạc còn nhiều hạn chế, đó là:
- Có sự chênh lệch về dòng điện khi đo trong dung dịch PBS và AFP nhƣng độ chênh lệch là không nhiều .
- Trong khi đo, độ nhiễu của tín hiệu điện là tƣơng đối lớn. Bên cạnh đó, nhóm vẫn chƣa tìm ra đƣợc nguyên nhân gây nhiễu là do sự không chuẩn xác của thiết bị đo hay đó là sự thăng giáng của dòng điện bởi sự đập nhả của các phân tử sinh học mang điện với bề mặt sợi.
Về hình thái học của sợi:
Với kích thƣớc nhỏ của các sợi (1um x 35µm ) và (2um x 14 µm), độ nhạy của cảm biến đạt tới thang đo mong muốn (dòng nA, nồng độ ng/ml). Tuy nhiên vì vùng làm việc của cảm biến là quá nhỏ, các thí nghiệm lại đo ở chế độ tĩnh (chƣa có các hệ pumping chuyên dụng để bơm dung dịch liên tực đến bề mặt sợi), do đó việc bắt cặp biomarker-receptor chỉ đƣợc thực hiện thông qua quá trình khuếch tán tự nhiên. Quá trình này rất chậm dẫn đến xác suất bắt các biomarker của bề mặt sợi là không cao.
Ngoài các khuyết điểm nêu trên, vẫn còn tồn tại một hạn chế lớn đó là sự bám của các phân tử của các chất chỉ thị sinh học lên thành của hệ giữ chip. Điều này dẫn đến tỉ lệ các phân tử sinh học có khả năng rơi vào vùng làm việc của chip thấp.
Ứng dụng FET sợi Si phát hiện các chất chỉ thị sinh học trong gan là một chủ đề thời sự trong lĩnh vực cảm biến sợi sinh học. Hiên nay, chƣa có công trình khoa học nào đƣợc công bố trong lĩnh vực ứng dụng chip sợi Si để phát hiện các chất chỉ thị sinh học trong gan nói chung hay AFP nói riêng. Nên chúng tôi không có cơ hội đối chiếu và so sánh.
II. Cách khắc phục hạn chế và hƣớng phát triển của đề tài
Để khắc phục những khó khăn, hạn chế trong quá trình đo phát hiện AFP, chúng tôi đề nghị cần tiến hành khắc phục các điểm chính sau:
Tính chất hình học của thiết bị cảm biến: chế tạo cảm biến sinh học sợi Si có kích thƣớc và mật độ thích hợp hơn trong quá trình phát hiện phân tử sinh học nhằm tăng khả năng các phân tử sinh học này tiếp xúc với vùng làm việc của chíp.
Thiết kế hệ bơm dung dịch chứa chất chỉ thị sinh học vào thẳng vùng làm việc của chíp. Trong hệ microfluidics, cần thiết kế hệ bơm với mục đích tạo chuyển động nhẹ của dung dịch trong giếng nhằm tăng khả năng bắt cặp của thụ thể trên bề mặt sợi với chất chỉ thị sinh học. Ngoài ra, cũng có thể sử dụng cách khác đó là tạo một ngõ vào và một ngõ ra, nhằm tạo sự lƣu chuyển của dung dịch trong giếng làm giảm sự bám của phân tử sinh học lên thành giếng đồng thời làm tăng khả năng bắt cặp của thụ thể với phần tử sinh học đó.
Sau khi đã khắc phục đƣợc các điểm hạn chế nói trên để nâng cao hiệu quả của cảm biến sinh học dựa trên cấu trúc sợi Si, thì các hƣớng phát triển tiếp theo là:
Thiết lập đƣờng chuẩn để định lƣợng các biomarker của ung thƣ gan. Đây là một trong các kết quả rất quan trọng, cho phép sử dụng cảm biến để định lƣợng các biomarker, sau đó ứng dụng trong chẩn đoán bệnh.
Nghiên cứu, phát hiện đồng thời nhiều biomarker trên cùng một chip. Việc này cho phép nâng cao tính chính xác của phép chẩn đoán.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Mulchandani A., Bassi A.S. (1995), “Principles and applications of biosensors for bioprocess monitoring and control”, Critical Reviews in Biotechnology, 15, pp. 105- 124.
2. Malhotra B.D., Asha Chaubey A. (2003), “Biosensors for clinical diagnostics industry”, Sensors and Actuators B, 91, pp. 117-127.
3. Rodriguez-Mozaz S., Marco M.P., Lopez de Alda M.J., Damià Barceló (2004), Biosensors for environmental monitoring of endocrine disruptors: a review article,
Analytical and Bioanalytical Chemistry, 378, pp. 588-598.
4. Rogers K.R., Mascini M. (1998), “Biosensors for eld analytical monitoring”, Field Analytical Chemistry and Technology, 2, pp. 317-331.
5. Rodriguez-Mozaz S., Lopez de Alda M.J., Marco M.P., Barcelo D. (2005), “Biosensors for environmental monitoring: a global perspective”, Talanta, 65, pp. 291- 297.
6. Prodromidis M.I. and Karayannis M.I. (2002), “Enzyme Based Amperometric Biosensors for Food Analysis”, Electroanalysis, 14: 241-261.
7. A. Kim, C. S. Ah, H. Y. Yu, J. H. Yang, I. B. Baek, C. G. Ahn, C.W. Park, M. S. Jun, and S. Lee, “Ultrasensitive, label-free, and real-time immunodetection using silicon field-effect transistors,” Appl. Phys. Lett.,vol. 91, pp. 103901-1–103901-3, 2007.
8. Di Tommaso et al., 2009. The application of markers (HSP70 GPC3 and GS) in liver biopsies is useful for detection of hepatocellular carcinoma. PubMed, 50(4):659- 61.
9. http:// www.aacc.org/.../LiverTumorMarkerLMPG/.../LiverTumorMarkersCh2.pdf 10. L. Hood, J. R. Heath, M. E. Phelps, B. Lin, Systems biology and new technologies enable predictive and preventative medicine, Science, 306, 640, 2004.
11. Le Thi Thanh Tuyen et al., Glucose oxidase immobilization on different modified surfaces of platinum nanowire for an application in the glucose detection, to be published in Adv. Nat. Sci.: Nanosci. Nanotechnol. 1 (2010).
12. Kelly Y. Kim Nanotechnology platforms and physiological challenges for cancer therapeutics, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 3 (2007) 103– 110.
13. Guo-Jun Zhang et al., Silicon nanowire biosensor for highly sensitive and rapid detection of Dengue virus, Sensors and Actuators B 146 (2010) 138–144.
14. Eric Stern et al., Label-free biomarker detection from whole blood, Nature Nanotechnology, Volume 5, Issue 2, pp. 138-142 (2010).
15. C. M. Lieber, Nanoscale Science and Technology: Building a Big Future from Small Things, MRS Bull., 28 (7), 486, 2003.
16. Q. Qing et al., Nanowire transistor arrays for mapping neural circuits in acute brain slices," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107, 1882-1887 (2010).
17. Y. Cui, C. M. Lieber, Functional Nanoscale Electronic Devices Assembled Using Silicon Nanowire Building Blocks, Science, 291, 851, 2001.
19. F. Patolsky, G. Zheng, O. Hayden, M. Lakadamyali, X. Zhuang, C. M. Lieber, Electrical detection of single viruses, Proc. Natl. Acad. Sci., 101, 14017, 2004.
20. Gengfeng Zheng et al., Multiplexed electrical detection of cancer markers with nanowire sensor arrays, Nature Biotechnology 23, 1294 - 1301 (2005).
21. Patolsky, B.P. Timko, G. Zheng and C.M. Lieber, Nanowire-Based Nanoelectronic Devices in the Life Sciences, MRS Bull. 32, 142-149, 2007.
22. F. Patolsky et al., Fabrication of silicon nanowire devices for ultrasensitive, label- free, real-time detection of biological and chemical species, Nat. Protocols 1, 1711- 1724, 2006.
23. Hien Duy Tong et al., Simple technique for direct patterning of nanowires using a nanoslit shadow-mask, Transducers 2007, 191-194, 2007.
24. Hien Duy Tong et al., Novel Top-Down Wafer-Scale Fabrication of Single Crystal Silicon Nanowires, Nanoletter , vol. 9, No.3, pp.1015-1022, March, 2009.
25. P. Offermans and Hien Duy Tong et al., Ultra-low Power Hydrogen Sensing With Single Palladium Nanowires, Apply Physic Letter, 2009.
26. V.J. Gadgil , Hien Duy Tong, Y. Cesa, M.L. Bennink, Fabrication of nano
structures in thin membranes with focused ion beam technology, Vol.203, No. 17-18, 2009, pp. 2436-2441.
27. Hien Duy Tong et al., Direct measurement of glucose concentrations in blood samples of diabetic patients, submitted to Nature nanotechnology, June, 2010.
28. Pham Xuan Thanh Tung et al., Oxidation of platinum microwires surface applied in glucose detection, accepted and to be published in Adv. Nat. Sci.: Nanosci.
Nanotechnol. 1 (2010).
29. Elfström, Niklas, Robert Juhasz, Ilya Sychugov, Torun Engfeldt, Amelie Eriksson Karlström, and Jan Linnros. “Surface Charge Sensitivity of Silicon Nanowires: Size Dependence.” Nano Letters 7, no. 9 (September 2007): 2608–2612.
30. A. Kim, C. S. Ah, H. Y. Yu, J. H. Yang, I. B. Baek, C. G. Ahn, C.W. Park, M. S. Jun, and S. Lee, “Ultrasensitive, label-free, and real-time immunodetection using silicon field-effect transistors,” Appl. Phys. Lett.,vol. 91, pp. 103901-1–103901-3, 2007.
31. G.I. Abelev and T.L. Eraiser, Cellular aspects of alpha-fetoprotein reexpression in tumors, Cancer biology, Volume 9, Issue 2, April 1999, Pages 95–107.
32. Mario Cottone et al., Screening for hepatocellular carcinoma in patients with Child's A cirrhosis: an 8-year prospective study by ultrasound and alphafetoprotein,
Journal of Hepatology, Volume 21, Issue 6, 1994, Pages 1029–1034.
33. Duy Hai Dinh et al., Route to Smooth Silica-Based Surfaces Decorated with Novel
Self-Assembled Monolayers (SAMs) Containing Glycidyl-Terminated Very Long Hydrocarbon Chains, American Chemical Society, Langmuir, 2009, 25 (10), 5526- 5535.
34. April K. Y. Wong and Ulrich J. Krull, Surface characterization of 3- glycidoxypropyl- trimethoxysilane films on silicon-based substrates, Anal Bioanal