- Phòng bệnh bằng vacxin
3.3.3.Phương pháp nghiên cứu
Phần III ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP
3.3.3.Phương pháp nghiên cứu
Để tiến hành nghiên cứu và thực hiện được các nội dung đã đề ra của đề tài, chúng tôi đã sử dụng kết hợp những phương pháp nghiên cứu thường quy và hiện đại trong lĩnh vực thú y, bao gồm:
a) Phương pháp gây bệnh thực nghiệm
- Bố trí thí nghiệm: Lợn thí nghiệm được chia thành 2 lô Lô1: Lô thí nghiệm dùng 6 con (kí hiệu TN1 đến TN6) Lô 2: Lô đối chứng dùng 2 con (kí hiệu ĐC1, ĐC2).
Thí nghiệm: Khu thí nghiệm đảm bảo có độ an toàn sinh học cấp II: Khu nuôi động vật thí nghiệm được vệ sinh sạch sẽ, thường xuyên phun thuốc sát trùng và các dụng cụ sử dụng luôn đúng quy định vô trùng, có màng lọc không khí, không để lây nhiễm mầm bệnh từ bên ngoài vào và từ phòng gây nhiễm sang phòng đối chứng.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
Quá trình gây nhiễm PRRS cho lợn thực nghiệm bao gồm 5 bước sau: Bước 1: Chọn lợn
Chọn 8 con lợn 2 tháng tuổi có trọng lượng từ 10-12 kg/con. Lợn được chọn là lợn không mắc PRRSV và một số virus khác như dịch tả lợn (CSF), lở
mồm long móng (FMD), Dịch tiêu chảy ở lợn con (PED) vàViêm dạ dày
ruột truyền nhiễm (TGE) và không có kháng thể kháng PRRSV. Bước 2: Theo dõi lợn trước khi gây nhiễm
Chọn lợn xong cần phải theo dõi lợn 1 thời gian trước khi gây nhiễm, vừa để lợn thích nghi với điều kiện sống mới vừa là để quan sát các biểu hiện bất thường của lợn. Ở đây chúng tôi tiến hành theo dõi 7 ngày trước khi gây nhiễm.
Hằng ngày phải theo dõi nhiệt độ của lợn, kiểm tra nhiệt độ 2 lần trong ngày vào buổi sáng và buổi chiều, theo dõi tình trạng sức khỏe, tình hình ăn uống, tình trạng lông da cũng như cân nặng của lợn.
Lấy máu kiểm tra xem có kháng thể PRRS trong máu không, đồng thời kiểm tra xem lợn có mắc các bệnh truyền nhiễm khác không… Lợn gây nhiễm phải khỏe mạnh, âm tính với PRRS và không mắc các bệnh truyền nhiễm khác như dịch tả lợn (CSF), lở mồm long móng (FMD), Dịch tiêu chảy ở lợn con(PED) và Viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE) Lợn không có kháng thể kháng PRRSV, âm tính với các bệnh truyền nhiễm thì ta tiến hành gây nhiễm cho lợn.
Bước 3: Gây nhiễm cho lợn
Gây nhiễm cho lợn bằng phương pháp khí dung.
Đưa virus PRRS vào cơ thể lợn qua đường niêm mạc mắt, đường miệng và chủ yếu là nhỏ mũi với liều 106 TCID50 3ml/con.
Bước 4: Theo dõi lợn sau khi gây nhiễm
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31
+ Theo dõi nhiệt độ của lợn mỗi ngày vào buổi sáng và buổi chiều. + Theo dõi tình trạng ăn uống,tình trạng sức khỏe.
+ Cần lấy máu định kì vào các thời điểm 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 và 21 ngày sau gây nhiễm để kiểm tra hàm lượng kháng thể có trong máu
+ Lấy dịch swabs, dịch mắt, phân hằng ngày để kiểm tra sự có mặt của virus trong cơ thể lợn.
Lợn thí nghiệm được theo dõi đến khi lợn chết hoặc kiểm tra không còn tồn tại virus trong máu thì tiến hành mổ khám lợn.
Bước 5: Mổ khám
Mổ khám lợn quan sát các bệnh tích đại thể, làm tiêu bản nhuộm HE kiểm tra bệnh tích vi thể, đồng thời làm tiêu bản nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) để xem sự phân bố của virus ở các cơ quan trong cơ thể. Từ đó đưa ra kết luận về khả năng gây bệnh của virus dựa trên khả năng gây bệnh của PRRSV-HY-09 cho lợn.
b) Phương pháp ELISA
Phản ứng Elisa kiểm tra kháng thể kháng virus PRRS được thực hiện bằng Kít ELISA của Median gồm các bước sau:
Bước 1: Hóa chất và dụng cụ của bộ Kít Elisa để ở nhiệt độ phòng. Bước 2: Bổ sung 100µl mẫu pha loãng trong DWP (Deep-well-plate) vào trong các giếng.
Bước 3: Bổ sung thêm 100µl thuốc thử đối chứng dương và đối chứng âm vào các giếng xác định.
Bước 4: Ủ tấm kháng nguyên trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 22-270C. Bước 5: Rửa tấm phủ kháng nguyên sau khi ủ ở bước 4 bằng dung dịch đệm Washing solution 300µl/lần/3 lần
Bước 6: Dùng khăn giấy lau nhẹ để loại bỏ hoàn toàn bộ dung dịch đệm còn sót lại.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32
Bước 7: Thêm 100µl HRPO anti-swine IgG vào từng giếng và ủ ấm trong vòng 30 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 8: Lặp lại bước 5 và bước 6
Bước 9: Thêm 100µl TMB substrate. Ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng, nếu phản ứng dương tính, tấm phủ kháng nguyên sẽ nổi rõ màu xanh nước biển.
Bước 10: Thêm vào 50µl TMP stop solution để dừng phản ứng. Màu sắc sẽ thay đổi sang màu vàng.
Bước 11: Đọc kết Độ hấp thụ quang (OD) quả bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 450nm.
- Kết quả:
Kiểm tra hiệu lực:
* Nếu đối chứng dương có giá trị OD ≥ 0,5, đối chứng âm có giá trị OD ≤ 0,3 thì phản ứng đạt yêu cầu để tính kết quả.
Tính toán kết quả:
CPC = OD (dương tính (PC)) – OD (âm tính (NC)) SP = OD (của mẫu) – OD (âm tính (NC))
tiêu chuẩn đánh giá kết quả như sau: + Nếu SP ≥ 0,4, phản ứng dương tính + Nếu 0.3 ≤ SP ≤ 0,4 phản ứng nghi ngờ + Nếu SP ≤ 0,3 phản ứng âm tính
c) Phương pháp quan sát, mô tả
Theo dõi hàng ngày: đo thân nhiệt, quan sát và ghi chép các biểu hiện lâm sàng.
d) Phương pháp mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể
Mổ khám nhằm xác định được các biến đổi đại thể của các cơ quan, tổ chức của lợn mắc PRRS, cần tiến hành mổ khám những lợn có biểu hiện triệu chứng lâm sàng rõ rệt của bệnh, những lợn chết vì bệnh. Lợn bệnh được cố định cẩn
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
thận, tiến hành lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ, thu dịch swabs (các dịch tự nhiên của cơ thể như nhử mắt, nước mũi, dịch ngoáy hầu họng) từ cơ thể nếu có. Tiến hành bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan nội tạng khỏi cơ thể quan sát và chụp ảnh, thu mẫu các cơ quan như: phổi, hạch, tim, gan, lách, thận.
e) Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý kiểm tra bệnh tích vi thể
Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể cần tiến hành làm tiêu bản để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng parafin, nhuộm Haematoxylin – Eosin (HE) theo phương pháp của phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
Cốđịnh bệnh phẩm:
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%.
Vùi bệnh phẩm:
Tiến hành lần lượt các bước sau:
- Rửa focmol: Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24 giờ. - Đưa mẫu vào hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động. Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động bao gồm 12 bình:
Bình Hoá chất Thời gian (giờ)
1 Cồn 600C 1:00 2 Cồn 600C 1:00 3 Cồn 700C 1:30 4 Cồn 800C 1:30 5 Cồn 960C 1:30 6 Cồn 1000C 1:30 7 Cồn 1000C 1:30 8 Cồn 1000C 1:30 9 Xylen 1:30
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34
10 Xylen 1:30
11 Parafin 2:00
12 Parafin 2:00
Đúc block (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đúc mẫu bệnh phẩm trong parafin
Cắt dán mảnh và cốđịnh tiêu bản
Cắt mảnh: bằng máy cắt microtom
Lát mảnh: lát cắt bằng phẳng trên phiến kính trong nước ấm 480C. Sau đó để tủ ấm 370C đến khi bệnh phẩm khô là có thể đem nhuộm được.
Nhuộm tiêu bản
Các bước tiến hành:
+ Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I : 6h
Xylen II : 6h Xylen III : 12h
+ Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 1000 : 2 lần (mỗi lần 1 phút)
Cồn 950 : 1 lần Cồn 700 : 1 lần Cồn 500 : 1 lần
+ Khử cồn: Cho dưới vòi nước chảy 15 phút + Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân tế bào)
Nhỏ Haematoxylin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nước. Sau đó cho tiêu bản qua hệ thống cồn:
Cồn 500 : 1 lần Cồn 700 : 1 lần Cồn 950 : 1 lần Cồn 1000 : 2 lần
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35
Rửa tiêu bản
+ Nhuộm Eosin (nhuộm nguyên sinh chất của tế bào) Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5 – 10 phút, rửa nước. Cho tiêu bản qua hai lọ cồn 1000 mỗi lọ 1 phút.
+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản đi qua xylen.
Gắn Baume canada
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản. Kiểm tra tiêu bản trên kính hiển vi quang học. f) Phương pháp RT – PCR
Phương pháp tách chiết RNA tổng số bằng hóa chất
Hóa chất cần chuẩn bị: Trizol, Chloroform, Isopropyl alcohol (2 – propanol), Ethanol 75%, RNAse – free water.
Các bước tiến hành:
Bước 1: Lấy 100µl virus PRRS vào ống eppendorf 1.5ml.
Bước 2: Bổ sung 1ml of Trizol vào ống trên và lắc đều, giữ 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 3: Bổ sung thêm 0.2ml chloroform vào ống và lắc đều giữ 3 phút
ở nhiệt độ phòng.
Bước 4: Ly tâm dung dịch ở 12.000 vòng trong 15 phút ở 40C.
Bước 5: Chuyển 350µl dịch nổi phía trên sang ống mới và bổ sung 500µl isopropyl alcohol, giữ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Bước 6: Ly tâm dung dịch ở 12.000 vòng trong 10 phút ở 40C.
Bước 7: Loại bỏ dịch nổi và giữ lại cặn, bổ sung 1ml ethanol 75% lặc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đều, ly tâm dung dịch ở 7.500 vòng trong 5 phút ở 40C.
Bước 8: Loại bỏ dịch nổi và giữ lại cặn để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36
- Phương pháp RT – PCR
Các bước tiến hành phản ứng RT – PCR: Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần phản ứng được trình bày ở bảng sau:
Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (µl)
2X Reaction Mix 12,5
Mẫu RNA 5,0
Primer Forward 0,5
Primer Reverse 0,5
RT/Platium Taq Mix 0,5
Nước cất 6
Tổng thể tích 25
Các mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR:
Mồi xuôi ATG TTG GGG AAG TGC TTG ACC Mồi ngược CTA GAG ACG ACC CCA TTG TTC CGC
Các mồi này nhằm khuếch đại đoạn gen ORF5 có kích thước 603 bp của virus PRRS.
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 50 30 phút 1 Duỗi mạch 95 5 phút 2 Duỗi mạch 95 15 giây 35 Gắn mồi 50 30 giây Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 Hoàn chỉnh 72 5 phút 1
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37
4 Giữ sản phẩm 4 ∞
Sản phẩm của phản ứng RT – PCR sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di.
- Phương pháp điện di
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Dung dịch đệm thường được sử dụng trong điện di agarose và polyacrylamid là TBE hoặc TAE, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng TAE và agarose để tạo bản gel.
Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm TAE 1X hòa tan với 1,5 gram agarose đặt trong lò vi sóng ở 1000C trong 5 phút, đổ vào khuôn có các lược được cài sẵn để tạo bản gel với các giếng tra mẫu cần điện di. Khi bản gel đã đông cứng đặt bản gel vào bể điện di và đổ dung dịch đệm TAE ngập bản gel khoảng 3 – 5mm.
Bước 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2µl loading dye vào 8µl sản phẩm RT – PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA (marker), thường sử dụng 4 – 6µl DNA Marker.
Bước 3: Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di thường sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 4: Nhuộm bản gel và đọc kết quả
Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra nhuộm Ethidium bromide hoặc SYBR green trong khoảng 5 đến 7 phút. Sau khi nhuộm bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 38
Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) có quy trình tẩm đúc bằng parafin giống phương pháp làm tiêu bản vi thể.
Các bước nhuộm:
Bước 1: Làm sạch tiêu bản
Khử parafin, khử xylen, khử cồn giống phương pháp làm tiêu bản vi thể. Sau khi cho chảy dưới vòi nước rửa lại tiêu bản bằng nước cất.
Bước 2: Hoạt hóa enzym
Ngâm ngập tiêu bản trong dung dịch PBS và hấp ướt ở 1210C/5 phút.
Bước 3: Khử peroxydase nội sinh
Dùng H2O2 trong dung môi Methanol (1H2O2 30% : 9 Methanol. Ngâm tiêu bản trong 10 phút.
Bước 4: Gắn kháng thể (KT)
Nhỏ 80µl KT PRRS/tiêu bản
Để tủ ấm 370C/1h hoặc 40C/qua đêm
Rửa tiêu bản bằng dung dịch PBS 3 lần (5 phút/lần).
Bước 5: Gắn kháng kháng thể
Nhỏ 2 giọt kháng kháng thể/tiêu bản Để tủ ấm 370C/1h
Rửa PBS 3 lần (5 phút/lần).
Bước 6: Cho cơ chất
Ngâm tiêu bản trong dung dịch DAB khoảng 5 – 8 phút
Kiểm tra dưới kính hiển vi thường: nếu nhìn thấy màu thì rửa tiêu bản qua nước; nếu không thì ngâm tiếp tiêu bản trong DAB đến khi nhìn thấy màu.
Bước 7: Nhuộm nhân tế bào bằng Haematoxylin (30s), làm sạch, gắn Baume
canada lên lamen nhanh trên tiêu bản và quan sát bằng kính hiển vi quang học.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39
Thống kê triệu chứng, nhiệt độ, hàm lượng kháng thể… sau các thời gian gây nhiễm virus, xử lý số liệu và vẽ biểu đồ biểu diễn tiến triển của bệnh, nhiệt độ, hàm lượng kháng thể …bằng phần mềm Microsoft Office 2007.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 40
Phần IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả gây bệnh thực nghiệm chủng PRRSV-HY-09