2.6.1. Phân tích nồng độ đƣờng bằng phƣơng pháp DNS
Các mẫu đƣờng thu đƣợc sau thủy phân đƣợc đem lọc hút bằng chân không. Dịch đƣờng đƣợc đem pha loãng để xác định nồng độ đƣờng bằng phƣơng pháp DNS [84]. Đƣờng khử là các đƣờng chứa nhóm aldehyde (−CHO) hoặc ketone (−CO) nhƣ glucose, fructose, arabinose, maltose, lactose, trừ đƣờng saccharose và trehalose.
47 Nồng độ (hàm lƣợng) đƣờng khử trong dịch đƣờng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp so màu trên máy đo quang (máy so mầu) OPTIMA SP-300 sử dụng dung dịch DNS (3, 5- dinitrosalixylic) có mầu vàng cam với thành phần hóa học nhƣ sau:
DNS (3-5 dinitrosalysilic ) : 3.532g NaOH : 6.6656 g C4H406KNa.4H2O : 102g Na2S2O5 : 2.771g C6H5OH : 2.53g H2O :472g Cách đo:
Pha loãng 1l dịch glucose nồng độ 0,4 g/l thành dung dịch có nồng độ 0,12; 0,16; 0,20; 0,24; 0,28; 0,32; 0,36 g/l, sau đó giữ dung dịch đƣờng ổn định trong vòng 2h trƣớc khi đo nồng độ. Lấy 2 ml dịch đƣờng cần xác định và 1ml dung dịch DNS cho vào ống nghiệm đun sôi trong vòng 5 phút, sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng rồi tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch trên máy đo quang SP300 ở bƣớc sóng 540 nm. Sau đó dựa vào biểu đồ đƣờng chuẩn để xác định nồng độ.
Xây dựng đồ thị đƣờng chuẩn
Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ đƣờng và độ hấp thụ có khoảng tuyến tính từ 0,12÷0,42 g/l. Nên để xác định đƣợc nồng độ của dịch thủy phân ta cần pha 1 dãy các nồng độ nằm trong khoảng đo và đo độ hấp thụ của các dung dịch đƣờng, ghi lại các số liệu.
Phƣơng trình đƣờng chuẩn có dạng nhƣ hình 2.9.
Hình 2.9. Sự phụ thuộc của nồng độ đƣờng khử và mật độ quang học
Đo độ hấp thụ của dịch thủy phân pha loãng nhƣ với dịch chuẩn. Từ độ hấp thụ đo đƣợc của dịch thủy phân dựa trên phƣơng trình đƣờng chuẩn đã biết, ta tính đƣợc nồng độ của mẫu trong dịch thủy phân.
48
2.6.2. Phân tích thành phần dung dịch đƣờng bằng phƣơng pháp HPLC
Thành phần dịch đƣờng thu đƣợc từ dịch thủy phân bằng enzyme các loại bột thu đƣợc từ rơm rạ đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp HPLC. Mẫu và dung dịch chuẩn đều đƣợc lọc qua màng 0,2 μm. Các dung dịch đƣờng chuẩn đƣợc pha từ đƣờng tinh khiết của Fluka với các nồng độ từ 0,05 g/l – 1,5g/l, sử dụng nƣớc cất khử ion. Chế độ phân tích đƣợc giữ ở nhiệt độ 60o
C, nhiệt độ RID 35oC, chế độ dòng 0,4 ml/phút.
Thông số của máy: Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nhãn hiệu Agilent HPLC 1200, điều kiện hoạt động phù hợp với khí hậu Việt Nam, nhiệt độ hoạt động từ 5÷50o
C, độ ẩm từ 5÷95%, tiêu chuẩn phù hợp GLP\GMP. Máy đƣợc trang bị bơm chân không khử khí G1322A. Cột phân tích Aminex HPX-87P, pha tĩnh: lead form, kích thƣớc hạt 9 μm, 8% cross linkage, dải pH hoạt động 5–9. Pha động là nƣớc khử ion đƣợc lọc qua màng 0,45 μm và khử khí. Phần mềm xử lý số liệu: Agilent 2D LC ChemStation Software (G2170BA).
Quá trình phân tích đƣợc tiến hành tại Phòng Kỹ thuật Thu hồi sản phẩm, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, phòng 305 nhà B1, Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội.
2.7. Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme xylanase và cellulase 2.7.1. Xác định hoạt độ endoglucanase 2.7.1. Xác định hoạt độ endoglucanase
Một đơn vị endoglucanase (CMC−ase) là lượng enzyme cần thiết để thủy phân CMC 2% ở điều kiện tiêu chuẩn trong một phút tạo ra 1 µmol glucose.
Glucose đƣợc xác định dựa trên phƣơng pháp xác định đƣờng khử với thuốc thử DNS nhƣ đã nêu ở mục 2.6.1. Mẫu thí nghiệm: Dùng pipet hút 1 ml dung dịch CMC 2,0% trong đệm phosphate pH 5,8 và 1 ml dịch enzyme vào ống nghiệm, đậy kín và ngâm ở 60oC trong 60 phút. Kết thúc phản ứng bằng cách bổ sung 2 ml dung dịch DNS. Hỗn hợp sau đó đƣợc đun sôi cách thủy trong 5 phút và làm lạnh nhanh ngay sau đó để kết thúc phản ứng. Mẫu đối chứng: Dùng pipet tự động hút 1 ml enzyme và 2 ml DNS vào ống nghiệm, đậy kín và để trong 10 phút. Sau đó bổ sung vào ống nghiệm 1 ml dung dịch CMC 2,0% trong đệm phosphate pH 5,8 và lắc đều. Đun sôi cách thủy ống nghiệm trong 5 phút và kết thúc phản ứng bằng cách làm lạnh trong nƣớc.
Đo mật độ quang của mẫu thí nghiệm so sánh với mẫu kiểm chứng ở bƣớc sóng 540nm, sử dụng đƣờng chuẩn glucose để tính toán kết quả [11,12].
2.7.2. Xác định hoạt độ exoglucanase
Một đơn vị exoglucanase (FPU-ase) là lượng enzyme cần thiết để thủy phân Whatman paper N. 1 ở điều kiện tiêu chuẩn trong một phút tạo ra 1 μmol glucose
Phƣơng pháp xác định hoạt độ exoglucanase tƣơng tự nhƣ đối với endoglucanase trong đó sử dụng cơ chất Whatman paper N.1 thay cho cơ chất CMC 2% [11,12].
49
2.7.3. Hoạt độ enzyme β-glucosidase
Một đơn vị hoạt độ beta–glucosidase là luợng enzyme có khả năng thủy phân cơ chất p–NPG tạo ra 1μmol p-nitrophenol trong thời gian 1 phút ở pH 4,7 và nhiệt độ 500C.
Nguyên tắc: Cơ chất p-nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside (p-NPG) bị phân cắt bởi enzyme tạo ra p-nitrophenol có khả năng tạo màu với Na2CO3 ( cho màu vàng). Cƣờng độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ p-nitrophenol đƣợc giải phóng ra trong một phạm vi nhất định. Dựa vào đồ thị chuẩn giữa giá trị độ hấp thụ quang (OD) đƣợc đo với các nồng độ p-nitrophenol đã biết, tính hoạt độ β–glucosidase. Sử dụng đồ thị đƣờng chuẩn giữa p-nitrophenol (0,02-0,18 μmol/ml) và mật độ quang tại 405 nm. Mẫu thí nghiệm: Hỗn hợp phản ứng gồm 0,2 ml dịch enzyme (đƣợc pha loãng ở nồng độ thích hợp) và 1ml cơ chất p-NPG 0,05M đƣợc giữ ở 50o
C trong 15 phút. Dừng phản ứng bằng 1ml Na2CO3 1M lạnh, thêm 1ml đệm axetat pH 5,5.
Mẫu kiểm chứng: 0,2 ml dịch enzyme hòa tan trƣớc với 1ml Na2CO3 1M lạnh trong 15 phút, sau đó cho thêm vào 1ml cơ chất – NPG 0,05M 1ml và đệm axetat pH 5,5.
Lƣợng p-nitrophenol giải phóng ra đuợc đo trên máy so màu quang điện ở bƣớc sóng 405 nm so với đối chứng [11,12].
2.7.4. Xác định hoạt lực xylanase
Một đơn vị hoạt độ xylanase (U) là lượng enzyme cần thiết đẻ thủy phân cơ chất xylan, giải phóng 1µmol đường D−xylose trong một phút ở điều kiện thí nghiệm.
Xylose đƣợc xác định dựa trên phƣơng pháp xác định đƣờng khử với thuốc thử DNS. Lƣợng đƣờng khử tạo thành trong phản ứng thủy phân đƣợc tính theo đồ thị đƣờng chuẩn xylose (0,1 đến 1,0 mg/ml)
Mẫu thí nghiệm: 100μl dung dịch enzyme + 900 μl dịch xylan, để phản ứng 15 phút ở 400
C, dừng phản ứng bằng 1,5 ml dung dịch DNS, đun trong nƣớc sôi 5 phút và làm lạnh trong nƣớc. Thêm 20 ml nƣớc khử ion hoặc nƣớc cất, lắc đều hỗn hợp trong ống nghiệm.
Mẫu đối chứng: 100 μl dung dịch enzyme + 1,5ml dung dịch DNS để bất hoạt xylanase + 900 μl dịch xylan, để ở 500
C trong 15 phút và làm lạnh trong nƣớc. Đun cách thủy mẫu đối chứng và thí nghiệm trong 5 phút, sau đó làm lạnh. Thêm 20 ml nƣớc khử ion hoặc nƣớc cất, lắc đều hỗn hợp.
Đo mật độ quang của mẫu thí nghiệm so sánh với mẫu kiểm chứng ở 540 nm. Sử dụng đƣờng chuẩn xylose để tính toán kết quả [11,12].
2.8. Phƣơng pháp lên men etanol 2.8.1. Lên men etanol dịch đƣờng thủy phân 2.8.1. Lên men etanol dịch đƣờng thủy phân
Sau quá trình thủy phân, dịch đƣờng đƣợc đƣa đi lên men bằng chủng nấm men
Saccharomyces cerevisiae BG1 lấy từ Bộ sƣu tập giống của Phòng Công nghệ Vật liệu sinh học - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
50 Lên men etanol theo phƣơng pháp tĩnh. Dịch sau khi thủy phân đƣợc bổ sung giống, quá trình nhân giống đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Nhân giống cấp 1: Giống cấp 1 đƣợc nuôi trong ống nghiệm, mỗi ống chứa 5ml nƣớc Hansen đƣợc hấp thanh trùng ở 115o
C trong 15 phút. Để nguội đến 30oC thì tiếp giống, lƣợng giống tiếp 1 vòng que cấy, nuôi lắc khoảng 24 giờ.
Nhân giống cấp 2: Giống cấp 2 đƣợc nuôi trong bình tam giác 250 ml, mỗi bình chứa khoảng 100 ml môi trƣờng Hansen, có bổ sung dịch thủy phân rơm rạ hấp thanh trùng ở 115oC trong 15 phút. Để nguội đến 30oC thì tiếp giống, lƣợng giống tiếp 5% giống cấp 1, nuôi lắc khoảng 24 giờ.
Chuẩn bị dịch lên men: Dịch thủy phân bột xút, bột sunfat, bột axetic rơm rạ sau thủy phân đƣợc ly tâm tách cặn và trƣớc khi lên men đƣợc bổ sung các chất nhƣ sau: (NH4)2SO4–0,3 %; KH2PO4–0,5%; MgSO4–0,05%; cao nấm men–0,3%. Lƣợng giống tiếp cho lên men là 8%).
Lên men etanol dịch đƣờng thu đƣợc sau quá trình thủy phân bột xút, sunfat và bột axetic từ rơm rạ đƣợc tiến hành ở nhiệt độ 30oC, thời gian 72 h, sử dụng chủng nấm men
Saccharomycescerevisiae BG1, tiếp giống 8%. Kết thúc lên men mẫu đƣợc đem chƣng cất thu etanol và xác định nồng độ etanol thu đƣợc bằng phƣơng pháp hóa học.
2.8.2. Xác định hàm lƣợng etanol bằng phƣơng pháp hóa học
Nguyên tắc của phƣơng pháp [133]:
Nồng độ cồn đƣợc xác định bằng axit dicromat (K2Cr2O7 0,05M trong H2SO4 2,5M). Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc: trong môi trƣờng axit, K2Cr2O7 oxi hóa ruợu trong dung dịch sau lên men thành axit axetic. Đồng thời ion Cr2O72- (màu vàng cam) bị khử thành Cr3+ (màu xanh). Nồng độ ion Cr3+ có thể đƣợc xác định bằng cách sử dụng máy so màu ở dải bƣớc sóng nhìn thấy (590 nm). Phƣơng trình (*) mô tả quá trình oxi hóa định lƣợng etanol bởi ion dicromat.
3CH3CH2OH + 2K2Cr2O72- + 8H2SO4→ 3CH3COOH + 2Cr2(SO4)3 + 11H2O (*)
(vàng cam) (xanh)
Lƣợng etanol có trong dịch là xác định, quá trình oxy hóa xảy ra cho tới khi toàn bộ lƣợng etanol có mặt phản ứng hết, khi đó màu vàng của dung dịch biến mất, và thay vào đó là màu xanh của Cr3+. Trong khoảng nồng độ cồn 0,05 đến 0,25% (% khối lƣợng) thì đƣờng biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ cồn và độ hấp thụ quang là tuyến tính. Dựa vào tính chất này ta có thể xác định nồng độ cồn sau lên men.
Phƣơng pháp pha và chuẩn bị hóa chất:
Chuẩn bị dung dịch K2Cr2O7 0,05M trong H2SO4 2,5M: Cân 12,4595 g K2Cr2O7 vào cốc nhỏ 50 ml, đổ từ từ vào cốc lớn chứa 139,08 ml axit H2SO4 trong cốc thủy tinh chịu nhiệt đã đƣợc làm mát và khuấy trộn đều tay cho đến khi tan hết. Tráng cốc nhỏ chứa K2Cr2O7 nhiều lần bằng nƣớc cất sạch và chuyển dung dịch thu đƣợc vào bình định mức
51 sẫm màu dung tích 1 lít. Thêm nƣớc cất đến vạch, đậy kín nắp và lắc đều bình dung dịch. Để dung dịch ổn định trong 1 ngày và lọc lại bằng giấy lọc.
Pha cồn chuẩn nồng độ 0,25%: chuẩn bị cồn tuyệt đối của Meck. Cân chính xác 0,25 g cồn tuyệt đối vào cốc nhỏ bằng cách nhỏ giọt cồn tuyệt đối từ pipet tự động (khoảng 3 ml) vào cốc nhỏ. Chuyển ngay sang bình định mức 100 ml khi cân xong để tránh cồn bay hơi và thêm nƣớc cất 2 lần đến vạch định mức. Lắc đều bình 23 lần và để ổn định.
Dựng đƣờng cồn chuẩn: pha loãng dung dịch cồn 0,25% thành 5 điểm nồng độ cồn nhƣ bảng 2.3.
Bảng 2.3. Bảng pha loãng cồn 0,25% cho phân tích nồng độ etanol
STT Nƣớc cất hai lần, ml Cồn 0,25 % Nồng độ dịch thu đƣợc, % 1 2,5 0,0 0,00 2 2,0 0,5 0,05 3 1,5 1,0 0,10 4 1,0 1,5 0,15 5 0,5 2,0 0,20
Dùng pipet tự động bổ sung 2,50 ml axit bicromat vào các ống nghiệm chứa 2,50 ml dung dịch cồn chuẩn hay dịch etanol chƣng cất đã pha loãng. Đun sôi ống nghiệm trong bếp cách thủy trong vòng 15 phút. Sau 15 phút lấy các ống nghiệm ra và để nguội hoặc làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Máy so màu chuẩn về không (0% truyền qua) khi không có cuvet. Cho cẩn thận dịch từ ống mẫu trắng vào cuvet sao cho định mức dịch cao khoảng 3 cm. Cho cuvet mẫu trắng (nƣớc cất 2 lần) vào máy và đƣa về 100% truyền qua hay 0% hấp thụ. Ghi lại độ hấp thụ mẫu trắng, sau đó cho về không, cho tiếp cuvet chứa dịch cồn cần xác định vào và ghi lại độ hấp thụ ở bƣớc sóng 590 nm.
Tính hiệu suất chuyển hóa đƣờng thành etanol:
Chuyển hóa đƣờng glucose dựa theo phƣơng trình cân bằng hóa học sau:
Phƣơng trình tổng quát chuyển hóa glucose thành etanol: từ đây tính hiệu suất chuyển hóa lý thuyết và thực tế quá trình chuyển hóa đƣờng thành etanol.
52
2.9. Phƣơng pháp xử lý số liệu và quy hoạch thực nghiệm Box−Behnken sử dụng phần mềm Design−Expert 7.0.0 Box−Behnken sử dụng phần mềm Design−Expert 7.0.0
2.9.1. Phƣơng pháp xử lý số liệu thực nghiệm và quy hoạch thực nghiệm
Sự sai khác giữa các số liệu đo đạc trong cùng một lần nghiên cứu TXL rơm rạ bằng các tác nhân khác nhau đƣợc lấy trung bình với 3 lần lặp lại.
Nghiên cứu ảnh hƣởng của các thông số công nghệ (mức dùng hóa chất (X1), nhiệt độ xử lý (X2), thời gian xử lý (X3)) trong quá trình TXL rơm rạ bằng các tác nhân khác nhau đến hiệu suất thu bột rơm rạ sau TXL (Y1) sao cho khi thủy phân bột rơm rạ sau TXL bằng enzyme thì thu đƣợc lƣợng đƣờng khử lớn nhất có thể (Y2), dẫn đến bài toán tìm cực trị (lƣợng đƣờng khử lớn nhất – Y2) khi thay đổi các yếu tố ảnh hƣởng nhƣ: mức dùng hóa chất, nhiệt độ, thời gian, tỷ dịch, áp suất, mức độ khuấy trộn ... trong quá trình TXL rơm rạ bằng các tác nhân khác nhau.
Bài toán tìm lƣợng đƣờng khử lớn nhất có thể thu đƣợc từ bột rơm rạ sau TXL khi thủy phân bột bằng enzyme đƣợc giải quyết ở mức độ nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng chính (mức dùng hóa chất, nhiệt độ, thời gian xử lý) đến hiệu suất thu bột và chất lƣợng bột thu đƣợc (sao cho bột dễ thủy phân và thủy phân thu đƣợc lƣợng đƣờng khử lớn nhất có thể); Bằng cách lập mô hình biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất và chất lƣợng bột vào các yếu tố ảnh hƣởng chính nêu trên để có thể điều khiển quá trình TXL rơm rạ.
Rõ ràng, sự thay đổi của từng yếu tố ảnh hƣởng và của tập hợp ba yếu tố ảnh hƣởng này trở thành một tập hợp lớn thực nghiệm nên trong nghiên cứu này chọn phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm với sự hỗ trợ của phần mềm Design Expert 7.0.0 (State−Ease, Inc., Minneapolis, Mỹ) nhằm làm giảm số lƣợng thực nghiệm và thu đƣợc lƣợng thông tin nhiều hơn, chính xác hơn.
2.9.2. Tối ƣu hóa các quá trình chế biến rơm rạ
Trong thí nghiệm xây dựng quy trình tối ƣu hóa lƣợng đƣờng khử thu đƣợc sau quá trình thủy phân bột rơm rạ bằng enzyme, các thí nghiệm đƣợc bố trí theo quy hoạch bậc hai Box−Behnken với nhân kế hoạch 2k
sử dụng phƣơng pháp bề mặt đáp ứng đƣợc xử lý bằng phần mềm tối ƣu hóa Design−Expert 7.0.0.
Xác định các khoảng chạy của các yếu tố ảnh hƣởng bằng các nghiên cứu sơ bộ. Xây dựng kế hoạch tối ƣu hóa TXL rơm rạ bằng xút (NaOH) và tác nhân sunfat (NaOH+Na2S) theo phƣơng pháp nấu kín (nghiên cứu ảnh hƣởng của mức dùng kiềm (X1), nhiệt độ (X2), thời gian (X3) đến hiệu suất bột (Y1) và hiệu suất đƣờng khử (Y2)). Phân tích các hệ số hồi quy của phƣơng trình mục tiêu, thiết lập bề mặt đáp ứng và tối ƣu hóa mục tiêu đƣờng khử theo phƣơng pháp hàm mong đợi. ANOVA đƣợc sử dụng để đánh giá các thông số thống kê và sự tƣơng thích của thực nghiệm với thực tế.
53
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm cấu tạo, tính chất lý học và thành phần hóa học cơ bản của rơm rạ một số giống lúa phổ biến ở Việt Nam bản của rơm rạ một số giống lúa phổ biến ở Việt Nam
Sự chuyển hóa các thành phần của vật liệu xơ sợi nguồn gốc thực vật thành etanol, không chỉ phụ thuộc vào các tác nhân (hóa chất, nhiệt, tác động cơ-lý học, enzyme, vi sinh vật…) của quá trình chuyển hóa, mà còn cả đặc điểm cấu tạo của vật liệu có vai trò quyết định hình thành tính chất lý học và thành phần hóa học của chúng. Cấu tạo của vật liệu đƣợc hình thành tự nhiên trong quá trình phát triển của chúng, tuy nhiên bị biến đổi tƣơng đối sau khi đƣợc khai thác để sử dụng. Đối với rơm rạ thuộc họ thân thảo ngắn ngày vốn có cấu tạo vách tế bào chƣa ổn định khi thu hoạch, vì vậy mà sự biến đổi về tính chất lý