1.3.6.1. Chuẩn bị dụng cụ và máy móc
Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy họat động tốt cho kết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng, năng lượng đèn... đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra. Đặc biệt cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghi ngờ về khả năng tách, và rửa đúng qui định sau mỗi lần chạy sắc ký. Ví dụ: Với sắc ký pha thuận NP-HPLC: rửa bằng MeOH, không rửa bằng nước.
Với sắc ký pha đảo RP-HPLC: Khi chạy pha động có các loại muối thì phải rửa nước trước cho sạch muối, sau đó rửa. Tỷ lệ ACN hay MeOH: Nước (50: 50) cho sạch hết các chất còn đọng lại trong cột đồng thời để bảo vệ cột không bị mốc khi để lâu. Tuyệt đối tình trạng chỉ rửa bằng nước 100% sau đó để cột một thời gian không sử dụng chắc chắn cột sẽ bị mốc, hỏng không thể dùng được. Lưu ý nếu rửa cột không tốt thì kết quả chạy sắc ký sẽ không thể đáp ứng được các yêu cầu phân tích.
1.3.6.2. Chuẩn bị dung môi pha động
Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết dùng cho HPLC.
Các hóa chất dùng phải là loại tinh khiết phân tích. Pha dung môi đúng, chính xác theo đúng tỷ lệ đã nêu, để ổn định dung môi đúng thời gian.
Mẫu thử xử lý mẫu thử theo đúng qui trình, theo nguyên tắc:
- Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động, trong nhiều trường hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu.
- Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được bằng cách lọc hay chiết…
- Phải lọc và ly tâm, lọc mẫu qua màng lọc 0,45 μm.
- Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột, có thể gây ra nghẽn cột.
Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi, riêng về nồng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần.
1.3.6.3. Cách đo HPLC
Mỗi máy có mỗi cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản xuất, phần mềm sắc ký. Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tắc:
- Chạy máy với dung môi pha động để đuổi hết bọt khí có trong hệ thống ống dẫn trước khi cho vào cột.
- Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký như: + Cấu hình máy.
+ Tỷ lệ các dung môi pha động.
+ Bước sóng, thành phần mẫu, các thông số của quá trình phân tích yêu cầu.