2.3.1. Lấy mẫu và baỏ quản mẫu
Lấy mẫu: Mười mẫu nấm được lấy từ vườn Quốc gia Pù Mát - Nghệ An
từ tháng 5 năm 2013. Lượng mẫu lấy phải đảm bảo nhu cầu phân tích, phù hợp phân tích định lượng, giữ nguyên hiện trạng và đúng thành phần.
Bảo quản mẫu: Quá trình bảo quản mẫu phải đảm bảo sao cho không
làm nhiễm bẩn hoặc mất chất phân tích. Mục đích để giữ và bảo toàn được chất phân tích do các hiện tượng tương tác hóa học, tự phân hủy chất, sự thủy phân, sa lắng. Các mẫu sau khi lấy về đem rửa sạch, phơi khô tự nhiên sau đó bảo quản trong túi nilon.
2.3.2. Chuẩn bị mẫu phân tích
Các mẫu nấm sau khi phơi khô tự nhiên được bảo quản trong túi nilon được đánh số thứ tự theo ký hiệu mẫu từ MN201, MN202, MN203, MN204, MN205, MN206, MN207, MN209, MN210, MN211.
Lấy mỗi mẫu nấm, dùng dao cắt thuốc bắc cắt phần mũ nấm thành từng mẫu nhỏ (không lấy phần cuống nấm) kích thước 3-5cm, mỗi mẫu khoảng 30g, nghiền thô nguyên liệu trong máy nghiền thích hợp tương đối mịn và trộn lại sao cho mẫu đồng nhất. Cần làm lạnh sơ bộ để tránh tiếp xúc với nhiệt độ cao trong thời gian dài. Tiến hành phân tích ngay sau khi mẫu được đồng hóa. Cho 10 mẫu đã nghiền nhỏ vào 10 chén sứ và ký hiệu mẫu lần lượt từ MN201, MN202, MN203, MN204, MN205, MN206, MN207, MN209, MN210, MN211 tương ứng. Sau đó lấy mỗi mẫu khoảng 2g đến 10g để đem xử lý mẫu.
2.4. CÁCH TIẾN HÀNH THỰC NGHIỆM
2.4.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn cho phép đo HPLC với vitami B1
- Dung dịch chuẩn gốc 100mg/l: Hòa tan 10mg chuẩn vitamin B1 (thiamin clorua hydroclorua) trong 100ml acid clohidric 1N.
- Dung dịch chuẩn làm việc nồng độ từ 1mg/l đến 10mg/l: Dùng pipet lấy từ 0,1ml đến 1ml dung dịch gốc thiamin clorua hydroclorua 100mg/l cho vào bình định mức 10ml. Sau đó cho vào mỗi bình định mức 3 ml dung dịch NaOH 15% trong K3Fe (CN)6 1% đã pha ở trên. Lắc trên máy lắc 1 phút, thêm isobutanol đến vạch định mức và lắc 30 giây. Để yên trong bóng tối 20 phút để tách lớp. Tách chiết dịch trong để bơm vào HPLC.
2.4.2. Xử lý mẫu nấm cho phép đo HPLC với vitamin B1
Cân một lượng mẫu thử thích hợp từ 2 gam đến 5 gam, chính xác đến mg, cho vào bình nón. Thêm một thể tích khoảng 100ml dung dịch acid clohydric 1N sao cho pH của dung dịch xấp xỉ bằng 1. Đem mẫu thủy phân trong nồi cách thủy 1h kể từ lúc nước sôi. Sau khi thủy phân xong, để nguội, chỉnh pH đến khoảng 3,75 - 4,75 bằng dung dịch CH3COONa 2,5N. Toàn bộ dung dịch này được chuyển vào bình định mức 250ml và định mức vừa đủ tới vạch bằng nước cất. Lọc qua giấy lọc. Hút 1 ml dịch lọc vào bình định mức 10ml. Sau đó cho vào mỗi bình định mức 3 ml dung dịch NaOH 15% trong K3Fe (CN)6 1% đã pha ở trên. Lắc trên máy lắc 1 phút, thêm isobutanol đến vạch định mức và lắc 30 giây. Để yên trong bóng tối 20 phút để tách lớp. Tách chiết dịch trong để bơm vào HPLC.
2.4.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn cho phép đo HPLC với vitamin B6
- Dung dịch chuẩn gốc 500mg/l: Hòa tan 71,7mg Pyridoxamin
dihidriclorua (C8H12N2O2.2HCl) trong bình định mức 100ml, định mức bằng nước cất đến vạch.
- Dung dịch chuẩn làm việc từ nồng độ 1mg/l đến 10mg/l: Dùng pipet lấy từ 0,2ml đến 2ml dung dịch gốc Pyridoxamin dihidriclorua
(C8H12N2O2.2HCl) cho vào bình định mức 100 và định mức đến vạch bằng nước cất. Ta được dãy chuẩn: 1mg/l; 2mg/l; 3mg/l; 4mg/l; 5mg/l; 6mg/l; 7mg/l; 8mg/l; 9mg/l; 10mg/l.
Hút 50ml mỗi chuẩn trong dãy trên vào bình nón 100ml, thêm 4,5ml dung dịch NaBH4 0,1M và 0,5 ml axit acetic tinh khiết. Lắc nhẹ 30 giây. Sau khi sủi hết bọt lọc qua màng lọc 0,45µm, bơm vào HPLC.
2..4.4. Xử lý mẫu nấm cho phép đo HPLC với vitamin B6
Cân một lượng mẫu thử thích hợp từ 2 gam đến 5 gam mẫu đã được đồng hóa chính xác đến mg, cho vào bình nón 50ml. Thêm 2ml dung dịch natriaxetat 0,625M; 2,5ml axit glyoxylic 1M và 0,8ml sắt (II) sulfate 10g/l. Lắc qua đêm trên máy lắc ngang (ít nhất 12h) ở 370C. Để nguội, chuyển vào bình định mức 50ml và định mức đến vạch bằng nước cất. Lọc qua giấy lọc. Dịch lọc sau khi lọc thêm tiếp 4,5ml dung dịch NaBH4 0,1M và 0,5 ml axit acetic tinh khiết. Lắc nhẹ 30 giây. Sau khi sủi hết bọt lọc qua màng lọc 0,45µm, bơm vào HPLC.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KHẢO SÁT CÁC THÔNG SỐ TỐI ƯU CHO PHÉP ĐO HPLC XÁC ĐỊNH VITAMIN B1, B6 XÁC ĐỊNH VITAMIN B1, B6
3.1.1. Khảo sát bước sóng
3.1.1.1. Khảo sát bước sóng kích thích và phát xạ của Vitamin B1
Pha dung dịch chuẩn làm việc Vitamin B1 có nồng độ 2,0 ppm. Tiến hành vận hành thiết bị ở các điều kiện theo các tài liệu đã tham khảo:
-Thành phần pha động: Methanol (HPLC).
- Cột sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm I.D.). - Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 10 μL.
- Detector: Thay đổi bước sóng kích thích từ 362nm đến 367nm và bước sóng phát xạ từ 432nm đến 437nm.
Kết quả khảo sát thể hiện trong bảng 3.1
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát bước sóng của Vitamin B1
kích thích (nm) 362 363 364 365 366 367
Phát xạ (nm) 432 433 434 435 436 437
Spic - 2,0ppm 2333547 2487465 2548357 2638964 2534783 2481746
%RSD 4,3260 4,0583 3,9613 3,8253 3,9825 4,0676
Như vậy qua kết quả khảo sát, dựa vào các tài liệu tham khảo và xuất phát từ yêu cầu xác định hàm lượng của Vitamin B1 nên chúng tôi chọn bước sóng kích thích là 365nm và bước sóng phát xạ là 435nm. Đây là bước sóng đảm bảo cho diện tích pic cao, độ lặp tốt, phù hợp với phép phân tích.
3.1.1.2. Khảo sát bước sóng kích thích và phát xạ của Vitamin B6
Pha dung dịch chuẩn làm việc Vitamin B6 có nồng độ 2,0 ppm.Tiến hành vận hành thiết bị ở các điều kiện theo các tài liệu đã tham khảo:
- Thành phần pha động: Methanol: axit phosphoric 0,01M điều chỉnh đến pH 2,5 (26: 74)
- Cột sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm I.D.). - Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 10 μL.
- Detector: Thay đổi bước sóng kích thích từ 288nm - 293nm và bước sóng phát xạ từ 393nm - 398nm.
Kết quả khảo sát thể hiện trong bảng 3.2
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát bước sóng của Vitamin B6
kích thích (nm) 288 289 290 291 292 293
Phát xạ (nm) 393 394 395 396 397 398
Spic - 2,0ppm 2007656 2028659 2047324 2037641 1893424 1854398
%RSD 4,1218 4,0791 4,0419 4,0611 4,3705 4,4624
Như vậy qua kết quả khảo sát, dựa vào các tài liệu tham khảo và xuất phát từ yêu cầu xác định hàm lượng của Vitamin B6 nên chúng tôi chọn bước sóng kích thích là 290nm và bước sóng phát xạ là 395nm. Đây là bước sóng đảm bảo cho diện tích pic cao, độ lặp tốt, phù hợp với phép phân tích.
3.1.2. Khảo sát pha động
3.1.2.1. Khảo sát pha động xác định hàm lượng Vitamin B1
Pha dung dịch chuẩn làm việc Vitamin B1 có nồng độ 2,0 ppm.Tiến hành vận hành thiết bị ở các điều kiện theo các tài liệu đã tham khảo:
- Pha động: Chọn một số hệ dung môi (HPLC) có độ phân cực tương đương với dung môi Methanol (HPLC), thay đổi tỉ lệ pha động, đo sắc ký với các thông số đã khảo sát, xác định diện tích pic.
- Cột sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm I.D.). - Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 10 μL.
- Detector: Bước sóng kích thích 365nm và bước sóng phát xạ là 435nm.
Kết quả khảo sát thể hiện trong bảng 3.3
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát pha động của Vitamin B1
Pha động Methanol: KH2PO4 0,01M
pH=2,5 (96: 4) Methanol
Methanol: Acetoniril (96: 4)
Spic - 2,0ppm 1783932 2678589 2342787
%RSD 15,33 9,87 11,29
Như vậy qua kết quả khảo sát, dựa vào các tài liệu tham khảo và xuất phát từ yêu cầu xác định hàm lượng của Vitamin B1 nên chúng tôi chọn hệ pha động Methanol. Đây là hệ pha động cho diện tích pic cao, độ lặp tốt, phù hợp với phép phân tích.
3.1.1.2. Khảo sát pha động xác định hàm lượng Vitamin B6
Pha dung dịch chuẩn làm việc Vitamin B6 có nồng độ 2,0 ppm. Tiến hành vận hành thiết bị ở các điều kiện theo các tài liệu đã tham khảo:
- Hệ pha động: Chúng tôi tiến hành thay đổi tỷ lệ pha động Methanol: axit phosphoric 0,01M điều chỉnh đến pH 2,5.
- Cột sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm I.D). - Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 10 μL.
- Detector: Bước sóng kích thích 290nm và bước sóng phát xạ là 395nm. Kết quả khảo sát trong bảng 3.4
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tỉ lệ hệ pha động của Vitamin B6
Methanol: acid heptane sulfonic 0,01N pH 2.5 24: 76 25: 75 26: 74 27: 73 28: 72 29: 71 Spic - 2,0ppm 2053902 2053529 2055462 2048923 2028932 2016546 %RSD 0,7904 0,7905 0,7898 0,7923 0,8001 0,8050
Như vậy qua kết quả khảo sát, dựa vào các tài liệu tham khảo và yêu cầu xác định hàm lượng của Vitamin B6 nên chúng tôi chọn hệ pha động Methanol: axit phosphoric 0,01M tỉ lệ 26:74; điều chỉnh pH 2,5. Đây là hệ pha động đảm bảo cho diện tích pic cao, độ lặp tốt, phù hợp với phép phân tích.
3.1.3. Khảo sát tốc độ dòng
3.1.3.1. Khảo sát tốc độ dòng xác định hàm lượng Vitamin B1
Pha dung dịch chuẩn làm việc Vitamin B1 có nồng độ 2,0 ppm.Tiến hành vận hành thiết bị ở các điều kiện như đã khảo sát và theo các tài liệu đã tham khảo:
- Pha động: Methanol (HPLC)
- Cột sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm I.D.). - Tốc độ dòng: Thay đổi tốc độ từ 0,8 - 1,3 mL/phút. - Thể tích tiêm mẫu: 10 μL.
- Detector: Bước sóng kích thích 365nm và bước sóng phát xạ là 435nm. Kết quả khảo sát thể hiện trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tốc độ dòng của Vitamin B1
V (ml/phút) 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3
Spíc - 2,0ppm 2645734 2725472 2812783 2719934 2674839 2546723
%RSD 3,3769 3,2781 3,1764 3,2848 3,3402 3,5082 Như vậy qua kết quả khảo sát, dựa vào các tài liệu tham khảo nên chúng tôi chọn tốc độ dòng tại giá trị 1,0 ml/phút. Đây là tốc độ đảm bảo cho độ hấp thụ cao, độ lặp tốt, phù hợp với phép phân tích.
3.1.3.2. Khảo sát tốc độ dòng xác định hàm lượng Vitamin B6
Pha dung dịch chuẩn làm việc Vitamin B6 có nồng độ 2,0 ppm. Tiến hành vận hành thiết bị ở các điều kiện như đã khảo sát:
- Hệ pha động: Methanol: axit phosphoric 0,01M điều chỉnh đến pH 2,5. - Cột sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm I.D).
- Tốc độ dòng: Thay đổi tốc độ dòng từ 0,8 - 1,3 mL/phút. - Thể tích tiêm mẫu: 10 μL.
- Detector: Bước sóng kích thích 290nm và bước sóng phát xạ là 395nm. Kết quả khảo sát thể hiện trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả khảo tốc độ dòng của Vitamin B6
V (ml/phút) 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3
Spíc - 2,0ppm 1936727 2017384 2051554 2043829 2017282 1954673
%RSD 2,4395 2,3420 2,3029 2,3116 2,3421 2,4171 Như vậy qua kết quả khảo sát, dựa vào các tài liệu tham khảo nên chúng tôi chọn tốc độ dòng tại giá trị 1,0 ml/phút. Đây là tốc độ đảm bảo cho độ hấp thụ cao, độ lặp tốt, phù hợp với phép phân tích.
3.2. KHẢO SÁT XÁC ĐỊNH KHOẢNG NỒNG ĐỘ TUYẾN TÍNH CỦA VITAMIN B1, VITAMIN B6 CỦA VITAMIN B1, VITAMIN B6
3.2.1. Khảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B1
Tiến hành pha dãy dung dịch chuẩn vitamin B1 có nồng độ từ 0,2mg/l đến 6,5 mg/l, tiến hành đo sắc ký của các dung dịch trên ở điều kiện tối ưu đã được khảo sát. Kết quả phân tích được trình bày trong bảng 3.7 và hình 3.1.
Bảng 3.7. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B1
TT Nồng độ dung dịch chuẩn (mg/l) Spíc 1 0,2 125634 2 0,4 234524 3 0,6 287683 4 1,0 1561348 5 2,0 2873557 6 3,0 4113628 7 4,0 5623561 8 5,0 6913452 9 5,5 6935276 10 6,0 7923528 11 6,5 8335279 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 0 1 2 3 4 5 6 7
Hình 3.1. Đồ thị khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B1 Nhận xét: Qua đồ thị khảo sát ta thấy khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B1 từ 0,5 mg/l đến 5,0 mg/l.
3.2.2. Khảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B6
Tiến hành pha dãy dung dịch chuẩn vitamin B6 có nồng độ từ 0,2 mg/l đến 6,5 mg/l, tiến hành đo sắc ký của các dung dịch trên ở điều kiện tối ưu đã được khảo sát. Kết quả phân tích được trình bày trong bảng 3.8 và hình 3.2.
Bảng 3.8. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B6
TT Nồng độ dung dịch chuẩn (ppm) Spíc 1 0,2 153768 2 0,4 321853 3 0,6 365983 4 1,0 1122537 5 2,0 2051563 6 3,0 3024356 7 4,0 3983217 8 5,0 5042316 9 5,5 6122537 10 6,0 8354287 11 6,5 9321876 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 0 1 2 3 4 5 6 7
Hình 3.2. Đồ thị khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B6 Nhận xét: Qua đồ thị khảo sát ta thấy khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B6 từ 1,0 mg/l đến 5,0 mg/l.
3.3. XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN, XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (LOQ) CỦA VITAMIN B1, HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (LOQ) CỦA VITAMIN B1, VITAMIN B6
3.3.1. Xây dựng đường chuẩn, xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của Vitamin B1 hạn định lượng (LOQ) của Vitamin B1
3.3.1.1. Xây dựng đường chuẩn của vitamin B1.
Pha các dung dịch chuẩn làm việc của vitamin B1 có nồng độ 1,0 mg/l; 2,0 mg/l; 3mg/l; 4,0mg/l; 5,0 mg/l. Tiến hành sắc ký ở các điều kiện đã khảo sát:
-Thành phần pha động: Methanol (HPLC).
- Cột sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5μm I.D.). - Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 10μL.
- Detector huỳnh quang: Đặt bước sóng kích thích 365nm và bước sóng phát xạ là 435nm.
Từ kết quả thu được khi khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính vitamin B1 (mục 3.2.1) chúng tôi dùng phần mềm origin 7.5 để xây dựng đường chuẩn của nguyên tố, đồng thời xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.9 và hình 3.3.
Bảng 3.9. Số liệu xây dựng đường chuẩn của vitamin B1
TT Nồng độ dung dịch chuẩn (ppm) Tổng Spíc Số liệu thống kê
1 0,5 785871 y = 1,355.106 x + 145612 r = 0,9996 2 1,0 1561348 3 2,0 2873557 4 3,0 4113628 5 4,0 5623561 6 5,0 6913452
Hình 3.3. Đồ thị đường chuẩn của vitamin B1
Phương trình đường chuẩn Data_B: Y= A*X + B
Thông số Giá trị Sai số
A B 1,355.106 145612 17301 52498 R SD N P 0,9996 31468 6 <0.0001
Tra bảng phân phối Student ta được giá trị t (P = 0,95; f = N-1 = 5) = 2,57 Theo kết quả tính toán của phần mềm origin 7.5 ta có:
∆A = t (0,95;4)*SA = 2,57*17301 = 44463 ∆B = t (0,95;4)*SB = 2,57*52498 = 134919
Vậy phương trình hồi quy đầy đủ của đường chuẩn có dạng: Ai = (1,355.106± 44463)* X + (145612 ± 134919) Trong đó:
Ai là diện tích píc của chất phân tích X là nồng độ của Vitamin B1 (mg/l)
3.3.1.2. Giới hạn phát hiện (LOD) của vitamin B1
LOD được xem là nồng độ của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền.
Giới hạn phát hiện Vitamin B1 bằng phép đo HPLC theo đường chuẩn:
y
6
3×S 3×31468
LOD= = =0,069ppm
A 1,355.10
3.3.1.3. Giới hạn định lượng (LOQ) của vitamin B1
LOQ được xem là nồng độ của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với mẫu trắng hay tín hiệu nền và đạt độ tin cậy ≥ 95%.
Giới hạn định lượng Vitamin B1 bằng phép đo HPLC theo đường chuẩn:
y
6
10×S 10×31468
LOQ= = =0,232ppm
A 1,355.10
3.3.2. Xây dựng đường chuẩn, xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của Vitamin B6 hạn định lượng (LOQ) của Vitamin B6
3.3.2.1. Xây dựng đường chuẩn của vitamin B6
Pha các dung dịch chuẩn làm việc Vitamin B6 có nồng độ 1,0 mg/l; 2,0 mg/l; 3mg/l; 4,0mg/l, 5,0 mg/l.Tiến hành đo sắc ký ở các điều kiện đã khỏa sát: