Gồm các bộ phận cơ bản sau: bình chứa dung môi pha động, bộ phận khử khí, bơm cao áp, bộ phận tiêm mẫu (bằng tay hay Autosample), cột sắc ký (Pha tĩnh) (để ngoài môi trường hay trong bộ điều nhiệt), detector (nhận tín hiệu), hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu, điều khiển hệ thống HPLC và in dữ liệu.
1.3.4.1. Bình đựng dung môi
Hiện tại máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp, cho phép chúng ta sử dụng 04 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 04 đường là 100%. Tuy nhiên, theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chi sử dụng tối đa là 2 và 3 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn, để quá trình rửa giải ổn định hơn. Hiện 4 đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải gradien dung môi theo thời gian và công tác xây dựng tiêu chuẩn.
Lưu ý:
- Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích.
- Tất cả các hóa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết phân tích, nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra các Peak tạp trong quá trình phân tích.
1.3.4.2. Bộ khử khí
Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động. Nếu như trong quá trình phân tích, dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ xảy ra:
- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng dẫn đến cho thời gian lưu của Peak thay đổi.
- Sinh bọt khí làn nhiễu đường nền, làm xuất hiện các pic lạ.
- Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể Pump sẽ không hút được dung môi, khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động.
Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai.
1.3.4.3. Bơm
Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm phải tạo được áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at đến 500 at (1at =0.98 Bar) và bơm phải tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999 ml/phút (hiện nay đã có nhiều loại Pump có áp suất rất cao lên đến 1200 bar), không bị ăn mòn bởi nhiều loại dung môi. Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường dùng bơm có áp suất tối đa 412 Bar. Tốc độ dòng: 0.1-9.999 ml/phút.Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt. Hiện tại thường dùng loại bơm có 2 pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục.
1.3.4.4. Bộ phận tiêm mẫu
Dùng để đưa mẫu vào cột phân tích. Có 2 cách đưa mẫu vào trong cột: tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay) và tiêm mẫu tự động (Autosample).
1.3.4.5. Cột sắc ký
Có rất nhiều nhãn hiệu cột khác nhau hiện bán trên thị trường. Chúng được chia làm nhiều loại theo mục đích sử dụng, trong đó chủ yếu là: cột pha đảo RP C18 (ODS), cột pha thường C8, các loại cột chuyên dụng cho từng nhóm chất. Cột C18 và C8 được sử dụng cho phần lớn các hợp chất thông thường.
Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao. Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10 - 30cm, đường kính trong 1-10mm.Thông thường chất nhồi cột là
Silicagel (pha thuận) hoặc là Silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm Oxit, polyme xốp, chất trao đổi ion. Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (Oven column).
1.3.4.6. Đầu dò
Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại Detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích.
A = k.C Trong đó:
A: là tín hiệu đo được. Tín hiệu này có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất …
C: Nồng độ chất phân tích
k: là hằng số thực nghiệm của Detector đã chọn. Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai Detector sau:
- Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để phát hiện UV. (Detector UV)
- Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV - VIS): 190 - 900 nm để phát hiện các chất hấp thụ quang và đây là loại thông dụng nhất.
- Detector huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng như các dẫn xuất có huỳnh quang và là loại Detector có độ chọn lọc cao nhất
- Loại hiện đại hơn có Detector Diod Array, ELSD (Detector tán xạ bay hơi) các Detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất
theo độ hấp thu cực đại của các chất. Ngoài ra còn có một số loại Detector khác nữa…
1.3.4.7. Bộ phận ghi tín hiệu
Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truyền sang.Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích của Peak, chiều cao…Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạytrên máy tính nó có thể lưu tất cả các thông số của Peak như tính đối xứng, hệ số phân giải... trong quá trình phân tích đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như: nồng độ, RSD%...
1.3.4.8. In kết quả
Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện.