7. Đóng góp mới của đề tài
2.3.5.Phương pháp xác định hoạt tính Cellulase của xạ khuẩn
Phương pháp nhỏ dịch
Nuôi lắc xạ khuẩn trên môi trường Gause I. Lắc 160 vòng/phút trong 3 ngày. Sau đó li tâm 4000 vòng/phút loại sinh khối.
Nhỏ 0,1ml dịch enzyme vào lỗ thạch trên hộp petri trong môi trường chứa cơ chất và thạch. Để hộp lồng vào trong tủ lạnh 8h, sau đó tiếp tục nuôi trong tủ ấm 24h. Tiến hành thử hoạt tính bằng thuốc thử rồi đo vòng phân giải.
Xác định hoạt tính cellulase bằng môi trường chứa 1% CMC hoặc bột giấy, thử bằng thuốc thử Lugol I [22], [24], [28].
Chiết dịch enzyme
Thu enzyme từ môi trường nuôi cấy đặc: cân 5g mẫu sinh khối nghiên cứu, nghiền nhỏ, cho vào bình nón có sẵn 70ml nước. Để vào tủ ấm 30ºC trong 30 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ. Định mức đến vạch, lắc đều, lọc. Dịch trong thu được là enzyme thô để dùng cho các thí nghiệm [5].Thu enzyme từ
môi trường lỏng: lọc bỏ sinh khối hoặc ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 15 phút, chiết rút lấy dịch trong thì thu được enzyme thô.
Phương pháp khuếch tán trên thạch
Chuẩn bị môi trường cơ chất + thạch (pH = 7,0 – 7,2) gồm 20 g thạch agar + 2 g CMC (hoặc 2 g bột cellulose) trong 1000ml nước. Thanh trùng ở 1atm trong 30 phút. Đổ môi trường vào các hộp petri sao cho bề dày lớp thạch khoảng 3mm. Dùng khoan nút chai đục lỗ (d = 10mm) trên lớp thạch cách nhau 40mm. Nhỏ 0,2ml dịch enzyme cần thử và 0,2ml H2O làm đối chứng, để trong tủ lạnh 4ºC khoảng 8 giờ, sau đó đặt vào tủ ấm 40ºC trong 24 giờ.
Hoạt tính enzyme được xác định bằng giá trị D – d (mm) sau khi nhuộm màu bằng thuốc thử lugol. Vùng CMC (hay glucose) bị phân giải không bắt màu ở xung quanh lỗ thạch [5].
Phương pháp xác định pH thích hợp
Xạ khuẩn được cấy vào môi trường ISP 1 đã điều chỉnh pH từ 3- 10. Nuôi ở tủ ấm 400C, sau 7 ngày đem ra quan sát sự sinh trưởng.