5. Điểm mới của đề tài
2.4.2. Phân lập tuyển chon xạ khuẩn
Phần đất rũ bỏ từ rễ đƣợc dùng làm mẫu phân lập xạ khuẩn theo tỉ lệ 9ml nƣớc cất/1g đất. Pha loãng đến nồng độ 10-4
. Từ dung dịch pha loãng 10-2 – 10-4 nhỏ 0,1 ml sang đĩa petri chứa môi trƣờng Gause – I.
Dùng que chang vô trùng chang đều, sau đó nuôi ở nhiệt độ phòng 4 – 7 ngày, các khuẩn lạc đƣợc làm sạch cấy truyền sang ống thạch nghiêng chứa môi trƣờng Gause – I, tiếp tục nuôi ở 10 – 14 ngày.
2.4.3. Phương pháp bảo quản chủng giống
Các chủng xạ khuẩn đã lựa chọn đƣợc cấy trên môi trƣờng thạch nghiêng Gause - I ở nhiệt độ phòng. Sau 10-14 ngày khi xạ khuẩn mọc tốt,
26
các ống giống đƣợc bảo quản trong tủ lạnh ở 4 - 6oC. Sau 2 - 3 tháng cấy truyền lại một lần.
2.4.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
Quan sát màu sắc của hệ sợi khí sinh
Dựa theo tài liệu của ISP, Gause và cộng sự (1983), xác định màu sắc của HSKS dựa vào bảng màu của Tresner và Bakus. Căn cứ vào màu sắc HSKS của các chủng mới phân lập để phân thành các nhóm màu theo Gause và cộng sự: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh…
Quan sát màu sắc của hệ sợi cơ chất
Màu sắc của HSCC đƣợc xác định qua quan sát trực tiếp trên môi trƣờng thạch đĩa hoặc thạch nghiêng và mô tả theo thang màu chuẩn của Bondarsev (1953), Tresner và cộng sự (1961).
Quan sát cuống sinh bào tử
Phương pháp 1: Phương pháp xẻ rãnh khối thạch
Xạ khuẩn đƣợc rải đều trên bề mặt hộp petri chứa môi trƣờng Gause – I. Dùng dao vô trùng xẻ hai đƣờng song song ở giữa hộp lồng, bỏ khối thạch ở giữa hai đƣờng xẻ ra ngoài. Sau đó đặt lamen vô trùng chéo theo rãnh thạch vừa xẻ. Để hộp lồng nuôi cấy trong tủ ấm 3 – 5 ngày, lấy lamen ra quan sát phần xạ khuẩn mọc lan ra hai đƣờng xẻ trên kính hiển vi quang học.
Phương pháp 2: Găm lamen nghiêng 45o
Xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Gause - I có găm lamen nghiêng 45o trên bề mặt môi trƣờng. Sau 7 - 9 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng lấy ra quan sát hình dạng chuỗi sinh bào tử trên lamen dƣới kính hiển vi quang học. Chuỗi sinh bào tử có dạng thẳng hay lƣợn sóng ký hiệu là RF (Rectus Flexibilis), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Rectinaculum Apertum) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spira).
27
Sự hình thành sắc tố tan
Xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Gause – I. Sau 7, 14, 21 ngày lấy ra quan sát sắc tố tan tiết ra môi trƣờng.
2.4.5. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh a. Nguyên tắc
Nếu VSV trên khối thạch có khả năng hình thành CKS thì chúng sẽ ức chế và tiêu diệt các VSV kiểm định và tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh khối thạch.
b.Tiến hành thí nghiệm
Phương pháp đục lỗ (xác định hoạt tính kháng sinh trong dịch thể)
Chuẩn bị dịch kháng sinh: nuôi lắc xạ khuẩn trên môi trƣờng dịch thể từ 5 – 7 ngày. Li tâm dịch lên men 4000 vòng/phút, loại bỏ sinh khối lấy dịch để thử hoạt tính kháng sinh.
Chuẩn bị VSV kiểm định: nuôi lắc VSV kiểm định trên môi trƣờng dịch thể thích hợp cho mỗi loại VSV kiểm định (Vi khuẩn trên môi trƣờng MPA).
Thử hoạt tính:
- Dùng micropipette nhỏ 100µl VSV kiểm định lên bề mặt môi trƣờng thạch sau đó chang đều bằng que chang vô trùng.
- Dùng khoan nút chai vô trùng khoan đĩa thạch thành các lỗ có đƣờng kính 1cm.
- Dùng micropipette nhỏ 100µl dịch kháng sinh vào lỗ thạch. Để hộp petri vào tủ lạnh trong 8h, sau đó nuôi trong tủ ấm 24 – 48h.
- Đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng sinh: đo vòng vô khuẩn xung quanh lỗ thạch, hoạt tính kháng sinh đƣợc đánh giá bằng giá trị D – d .
Trong đó: D là đường kính vòng vô khuẩn (mm). d là đường kính lỗ thạch (mm).
(D-d) 25 mm: hoạt tính rất mạnh; (D-d) 20 mm: hoạt tính mạnh.
28
2.4.6. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả bằng toán học
Chúng tôi xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng pháp nhƣ:
Số trung bình cộng: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm: 1 1 n i i X X n
Trung bình bình phƣơng các sai lệch:
1 ) ( 1 2 n X X n i i
Sai số đại diện của trung bình cộng: m n
29
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.Phân lập xạ khuẩn từ vùng rễ cây rau dệukhu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc
Theo phƣơng pháp lấy mẫu nhƣ trên, vào các tháng 10, 12 năm 2013 và tháng 2 năm 2014, tôi đã thu thập đƣợc 3 mẫu cây rau dệu từ đất trồng với các độ sâu khác nhau tại 3 địa điểm khác nhau trong khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên , Vĩnh Phúc:
1. Ở đất trồng rau dệu vành đai Xuân Hòa với độ sâu 3cm. 2. Ở đất trồng rau dệu vƣờn Yên Mỹ với độ sâu 5cm. 3. Ở đất trồng rau dệu ruộng Yên Mỹ với độ sâu 7cm.
Sau khi thu mẫu, chúng tôi đã tiến hành phân lập các mẫu đất và mẫu rễ rau dệu trên môi trƣờng Gause - I tại phòng thí nghiệm vi sinh, khoa Sinh – KTNN trƣờng ĐHSPHN2. Căn cứ vào mật độ xạ khuẩn trong các mẫu đất và rễ, tôi chọn dịch đất có độ pha loãng 10-2 – 10-4 của các mẫu đất và rễ để phân lập.
Sau 5 – 7 ngày lấy ra quan sát những khuẩn lạc mọc đƣợc trên đĩa petri. Kết quả trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc từ vùng rễ cây rau dệu
Tháng Địa điểm Độ sâu Độ pha loãng Chủng XK
10 Vành đai 3 cm Đất 10-2 DD1, DD2, DD3, DD4 10-3 DD5, D6, DD7, DD8 10-4 DD9 Rễ DR1
30 12 Vƣờn Yên Mỹ 5 cm Đất 10-2 DD10, DD11, DD12 10-3 DD113, DD14 10-4 DD15, DD16 Rễ DR2 2 Ruộng Yên Mỹ 7 cm Đất 10-2 DD17, DD18, DD19 10-3 DD20, DD21 10-4 Rễ
Ghi chú: DD: Các chủng xạ khuẩn phân lập được từ đất DR: Các chủng xạ khuẩn phân lập được từ rễ cây rau dệu
Trên môi trƣờng Gause I cả xạ khuẩn, nấm mốc và một số vi khuẩn đều mọc. Nhƣng có thể phân biệt rõ ràng các khuẩn lạc này: Khuẩn lạc vi khuẩn thƣờng nhày, ƣớt nhẵn. Khuẩn lạc nấm mốc cũng có nhiều màu sắc nhƣ khuẩn lạc xạ khuẩn nhƣng khác ở chỗ nó phát triển nhanh và to hơn khuẩn lạc xạ khuẩn nhiều lần. Khuẩn lạc xạ khuẩn thì bông xốp, khô rắn chắc, xù xì, dạng da, dạng nhung, dạng phấn, nhìn kĩ có dạng sợi nấm nhƣng đƣờng kính sợi bé hơn sợi nấm rất nhiều chỉ bằng 1 đến 2 phần 10 đƣờng kính sợi nấm, nếu không có HSKS thì khuẩn lạc có dạng màng dẻo. Sau 3 ngày phát triển khuẩn lạc xạ khuẩn có kích thƣớc khoảng 0,5 – 2 mm.
31
Hình 3.1. Một số chủng xạ khuẩn phân lập được từ vùng rễ cây rau dệu
a. Mặt trên của các chủng xạ khuẩn DD8, DR1, DD1, DR2 phân lập được b. Mặt dưới của các chủng xạ khuẩn DD8, DR1, DD1, DR2 phân lập được c. Mặt trên của các chủng xạ khuẩn DD5, DD6, DD11, DD13 phân lập được d. Mặt dưới của các chủng xạ khuẩn DD5, DD6, DD11, DD13 phân lập được
Quan sát các mẫu phân lập sau 5 -7 ngày nuôi cấy thu được23 chủng xạ khuẩn khác nhau thuộc chi Streptomyces từ vùng rễ cây rau dệu của khu vực nghiên cứu. Trong đó có: 21 chủng thu được từ đất và 2 chủng từ rễ cây rau dệu. Điều đó cho thấy ở trong đất có số chủng xạ khuẩn nhiều hơn so với ở rễ cây rau dệu.
3.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc
Tiến hành nghiên cứu đặc điểm HSKS, HSCC… của các chủng xạ khuẩn đã phân lập đƣợc. Nuôi cấy các chủng này trên môi trƣờng Gause I, sau 5 – 7 ngày đem quan sát. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.2.
a b
32
Bảng 3.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc
STT Chủng xạ khuẩn Màu sắc khuẩn lạc
HSKS HSCC
1 DD1 Trắng Xanh Xanh đen
2 DD2 Vàng nhạt Vàng nâu 3 DD3 Nâu xám Trắng 4 DD4 Trắng Vàng 5 DD5 Hồng Nâu đen 6 DD6 Trắng Tím đen 7 DD7 Đỏ nâu Đỏ đen 8 DD8 Trắng Vàng 9 DD9 Trắng Vàng đậm 10 DD10 Trắng Vàng 11 DD11 Nâu Vàng 12 DD12 Hồng nhạt Nâu đen 13 DD13 Trắng Vàng nâu 14 DD14 Trắng Vàng nhạt 15 DD15 Trắng Trắng 16 DD16 Trắng Trắng 17 DD17 Trắng Vàng 18 DD18 Trắng Trắng 19 DD19 Trắng Trắng 20 DD20 Trắng Đen 21 DD21 Vàng nâu Vàng 22 DR1 Nâu xám Hồng nhạt 23 DR2 Trắng Hồng đậm
33
Khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập chủ yếu có dạng xù xì hoặc dạng bẹt, có kích thƣớc khá nhỏ so với khuẩn lạc của các loại vi sinh vật khác, khoảng 0,5 – 2 mm. Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn với hƣớng sinh trƣởng trong môi trƣờng tạo ra HSCC và mặt ngoài môi trƣờng tạo ra HSKS. Màu sắc của HSKS và HSCC rất đa dạng và phong phú: trắng, vàng, nâu, xám, hồng, xanh… và đây là một trong những đặc điểm để phân loại xạ khuẩn, nhờ vào đó ta có thể xác định xạ khuẩn đƣợc phân lập thuộc chi nào, họ nào, ngành nào…
DD5 DR2
Hình 3.2. Khuẩn lạc của một số chủng xạ khuẩn phân lập được
Qua kết quả phân lập xạ khuẩn dƣợc thống kê trong 2 bảng 3.1 và 3.2 có thể rút ra nhận xét sau:
Cả 3 loại đất vành đai, đất vƣờn, đất ruộng có số lƣợng xạ khuẩn trung bình trong 1g đất khô giảm dần theo chiều sâu lấy mẫu. Điều này hợp quy luật vì xạ khuẩn thuộc loại vi sinh vật hiếu khí nên ở các lớp đất trên thoáng khí hơn có số lƣợng xạ khuẩn nhiều.
Sau khi phân lập, chúng tôi đã thu thu đƣợc các khuẩn lạc xạ khuẩn riêng biệt trên các hộp petri, chọn những khuẩn lạc mọc tốt, không bi nhiễm cấy truyền sang các ống thạch nghiêng chứa môi trƣờng Gause – I. Nuôi giữ trong tủ ấm ở nhiệt độ 28 – 30oC, sau 5 – 7 ngày lấy ra quan sát, những ống nghiệm
34
nào bị nhiễm, chƣa thuần chủng thì đƣợc phân lập lại. Kết quả chúng tôi thu đƣợc 21 chủng xạ khuẩn từ 3 mẫu đất và 2 chủng xạ khuẩn từ 3 mẫu rễ. Căn cứ vào màu sắc hệ sợi khí sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc, chúng tôi chia thành 6 màu nhƣ sau:
Màu trắng: 15 chủng chiếm 65,22 %. Màu nâu: 3 chủng chiếm 13,04 %. Màu vàng: 2 chủng chiếm 8,69 %. Màu trắng xanh: 1 chủng chiếm 4,35 %. Màu đỏ: 1 chủng chiếm 4,35 %.
Màu hồng: 1 chủng chiếm 4,35%.
Như vậy trong số 23 chủng xạ khuẩn phân lập được từ vùng rễ cây rau dệu ta thấy màu sắc HSKS và HSCC rất phong phú: trắng, vàng, nâu, xám, hồng, xanh… Trong đó số chủng xạ khuẩn có màu trắng chiếm tỷ lệ 15/23, các chủng màu nâu 3/23; màu vàng 2/23; các chủng màu trắng xanh, màu đỏ, màu hồng chiếm tỷ lệ 1/23.
3.3. Xác định khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn
Từ 23 chủng xạ khuẩn đã phân lập,tôi tiến hành xác định hoạt tính kháng sinh với việc sử dụng các VSV kiểm định Gr+ (Baciluss), Gr- ( E. coli) theo phƣơng pháp nhƣ trên. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.3 và bảng 3.4.
35
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc từ vùng rễ cây rau dệu ở khu vực Xuân Hòa,
Phúc Yên, Vĩnh Phúc STT Chủng XK nghiên cứu Hoạt tính kháng sinh (D - d) ±m (mm) Bacillus E. coli 1 DD1 0 2± 0,15 2 DD2 3± 0,14 0 3 DD3 4± 0,23 3± 0,25 4 DD8 5± 0,31 7± 0,32 5 DD12 10± 0,12 0 6 DD15 3± 0,25 0 7 DD18 4±0,13 0 8 DD21 2±0,11 0
Ghi chú : D = đường kính vòng vô khuẩn, d = 10 mm đường kính khối thạch.
Trong 23 chủng xạ khuẩn phân lập từ vùng rễ cây rau dệu thì 8 chủng: DD1, DD2, DD3, DD8, DD12, DD15, DD18, DD21 có hoạt tính kháng sinh còn lại 15 chủng không có hoạt tính kháng tính kháng sinh.
36
Bảng 3.4. Kết quả thống kê hoạt tính kháng sinh các chủng xạ khuẩn phân lập từ vùng rễ cây rau dệu
STT VSV kiểm định Số chủng XK phân lập đƣợc Hoạt tính kháng sinh ( D - d, mm) Tổng số chủng XK có HTKS Mức độ hoạt tính Yếu Trung bình Mạnh Rất mạnh 1 Bacillus 23 6 1 0 0 7 2 E. coli 23 3 0 0 0 3
Ghi chú: (D - d) 25 mm: hoạt tính rất mạnh; (D - d) 20 mm: hoạt tính mạnh (D - d) 10-19,5mm: hoạt tính trung bình; (D - d) 10 mm: hoạttính yếu
37
Hình 3.3. Hình ảnh thử hoạt tính kháng sinh của một số chủng xạ khuẩn nghiên cứu
Qua bảng 3.3 và 3.4 cho thấy:
Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc từ vùng rễ cây rau dệu với các VSV kiểm định ở các mức độ mạnh yếu khác nhau.
Có 7/23chủng xạ khuẩn có khả năng chống lại VK Gr+ . Có 3/23 chủng xạ khuẩn có khả năng chống lại VK Gr-.
So sánh với các nghiên cứu khác cũng về khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn trong nƣớc nhƣ Đỗ Thu Hà (2004), Bùi Thị Hà (2008), Lƣơng Thị Hƣơng Giang (2011) thì 2 chủng DD8 và DD12 mà chúng tôi thu đƣợc có hoạt tính kháng sinh thấp hơn.
Căn cứ vào kết quả thu đƣợc tôi đƣa ra một số nhận xét sau:
38
độ sâu khác nhau thì sự phân bố của xạ khuẩn là khác nhau; Qua nghiên cứu tôi đã phân lập được 8 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh. Trong đó xác định được 2 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh mạnh hơn cả đó là chủng DD8 (với VSVKĐ là E.coli) và DD12 (với VSV kiểm định là Bacillus). Từ đó tôi đã lựa chọn 2 chủng này để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.4. Đặc điểm hình thái và sắc tố tan của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu
Tôi tiến hành nuôi cấy các chủng DD8, DD12 trên môi trƣờng Gause – I để quan sát khả năng sinh trƣởng của chúng và màu sắc của hệ khuẩn ty. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Chủng DD8: HSKS màutrắng, HSCC màu vàng, sắc tố tan màu vàng nhạt thời gian xuất hiện khuẩn lạc 24 – 48h, cuống sinh bào tử có dạng xoắn.
Chủng DD12: HSKS màu hồng nhạt, HSCC màu nâu đen, sắc tố tan nâu đỏ, thời gian xuất hiện khuẩn lạc 24 – 48h, cuống sinh bào tử có dạng thẳng.
DD8DD12
Hình 3.4. Cuống sinh bào tử và bào tử của các chủng xạ khuẩn nghiêncứu trên kính hiển vi quang học x 1000 lần
Bào tử của xạ khuẩn đƣợc hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh – gọi là cuống sinh bào tử. Đó là cơ quan sinh sản đặc trƣng cho xạ khuẩn. Hình thái cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn. Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thƣờng có hình
39
trụ, ô van, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông [9]. Tuy nhiên, số lƣợng bào tử và hình dạng của chuỗi là khác nhau ở các đơn vị phân loại khác nhau.
Bào tử xạ khuẩn đƣợc bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 – 400A0 chia 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác động bất lợi từ ngoại cảnh nhƣ nhiệt độ, pH,... Hình dạng, kích thƣớc chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tƣơng đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trọng phân loại xạ khuẩn [13].
Hình 3.5. Hình ảnh sắc tố tan của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu
Kết quả trên cho thấy tùy từng chủng xạ khuẩn khác nhau mà màu sắc của khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh và sắc tố tan là khác nhau. Vì vậy việc nghiên cứu sắc tố tan giúp ta thêm cơ sở để phân loại xạ khuẩn.
Qua nghiên cứu ta thấy 2 chủng DD8 và DD12 có khả năng hình thành sắc tố tan.
40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
1.1. Từ 3 mẫu cây rau dệu đã thu đƣợc 23 chủng xạ khuẩn khác nhau thuộc chi
Streptomyces. Trong đó có 21 chủng thu đƣợc từ đất và 2 chủng thu đƣợc từ