5. Điểm mới của đề tài
1.5. Tình hình nghiêncứu xạ khuẩ nở Việt Nam
Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn ở Việt Nam đang nở rộ. Các chủng xạ khuẩn đƣợc nghiên cứu về nhiều mặt: tối ƣu hóa môi trƣờng nuôi cấy (Bùi Việt Hà, 1998, Lê Gia Huy, 1994…), nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn (Biền Văn Minh, 2000 – 2004), tìm hiểu khả năng sử dụng dầu mỏ của một số chủng xạ khuẩn (Lại Thúy Hiền và cs, 1998)…, trong các nghiên cứu đó thì việc nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh kháng các vi sinh vật gây bệnh của các chủng xạ khuẩn cũng là một trong những vấn đề đang đƣợc qua tâm (Kiều Hữu Ảnh và cs, 2003; Lê Gia Huy và cs, 1992, 1994, 2005).
22
Những nghiên cứu kháng sinh của Việt Nam đƣợc mở đầu bằng việc sử dụng dịch nuôi cấy nấm Penicillium để chữa trị cho các thƣơng binh trong chiến tranh năm 1949 do GS. Đặng Văn Ngữ tiến hành. Tuy nhiên, 6 năm sau penicillin mới đƣợc tinh chế.
Tiếp sau công trình đầu tiên đó, các nghiên cứu về chất kháng sinh tiếp theo đƣợc thực hiện tại Đại học Dƣợc Hà Nội, Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Đại học Sƣ phạm Hà Nội. Tại đây đã nghiên cứu, phân lập, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh kháng sinh mạnh, xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa của chất kháng sinh, sơ bộ định loại nhóm kháng sinh.
Cho đến năm 2000, việc nghiên cứu và thử nghiệm sản xuất thuốc kháng sinh ở Việt Nam bƣớc đầu đã có những thành công nhất định. Dây truyền sản xuất kháng sinh đầu tiên của Việt Nam đạt tiêu chuẩn GMP đƣợc lắp đặt tại Xí nghiệp Dƣợc phẩm Trung Ƣơng I với sản phẩm kháng sinh β – lactam dạng bột, độ tinh khiết cao có thể dùng để tiêm.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng và bƣớc đầu mạng lại thành công, nhƣng trình độ trong nghiên cứu CKS của chúng ta còn thấp so với thế giới. Một trong những hạn chế này là đa số các nghiên cứu hiện nay vẫn chỉ dừng lại ở phân lập, tuyển chọn chủng sinh kháng sinh. Tách chiết, tinh sạch, định tên kháng sinh vẫn là công việc đắt đỏ, yêu cầu phối hợp nghiên cứu nên mới chỉ thực hiện ở một số cơ sở nghiên cứu lớn. Tập chung nghiên cứu tìm kiếm kháng sinh mới và ứng dụng sản xuất kháng sinh cần đƣợc đẩy mạnh hơn nữa, nâng cao trình độ nghiên cứu và đáp ứng nhu cầu chăm sóc và bảo vệ sức khỏe con ngƣời, giảm thiểu nhập khẩu kháng sinh.
23
CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Mẫu cây
Mẫu nghiên cứu là cây rau dệu thu thập từ các địa điểm khác nhau của khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc.
2.1.2. Mẫu đất
Các mẫu đất đƣợc lấy ở các độ sâu khoảng 3 – 7cm tại các địa điểm khác nhau của khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên,Vĩnh Phúc.
2.1.3. Vi sinh vật kiểm định
Hai chủng vi sinh vật chủ yếu đƣợc sử dụng để kiểm định hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc từ vùng rễ cây rau dệu đó là vi khuẩn Bacilluss và vi khuẩn E.coli
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.1. Hóa chất
- Các loại đƣờng chuẩn: glucose, saccarose... của hãng Merck (Đức), Trung Quốc sản xuất.
- Các loại muối: K2HPO4, KH2PO4, MgSO. 7H2O, KNO3, NaCl, FeSO4. 7H2O, (NH4)2SO4, CaCO3, Na2CO3... nhập từ Trung Quốc, Anh sản xuất.
- Các loại cao: Cao thịt, cao nấm men, peptone... của hãng Merck ( Đức). - Các loại hóa chất khác: thạch, tinh bột tan, CMC (Carboxyl Methyl Cellulose)... của Nhật, Trung Quốc, Việt Nam sản xuất.
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy Binder; Nồi hấp (TOMY – Nhật); Máy lắc; Máy li tâm (Shorwall super T21 – Mỹ); Cân điện tử (Presica XT 320M – Thụy Sĩ); Kính hiển vi quang học; Các dụng cụ khác trong Phòng thí nghiệm Vi sinh vật thuộc khoa Sinh – KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
24
2.3. Môi trƣờng
2.3.1. Môi trường phân lập, bảo quản và giữ giống xạ khuẩn
Môi trường Gause I
K2HPO4 0,5 g FeSO4 (dạng vết) 0,01 g
KNO3 1 g Thạch agar 20 g
MgSO4. 7H2O 5 g pH 7,2
NaCl 0,5 g Nƣớc cất 1000 ml
2.3.2. Môi trường thử hoạt tính kháng sinh
Môi trƣờng MPA nuôi cấy giữ giống vi khuẩn kiểm định.
Môi trường MPA
Peptôn 5,0g Thạch 20,0g NaCl NaCl 5,0g Nƣớc cất 1000ml
Cao thịt 5,0g pH= 7,5
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1.Phương pháp thu mẫu và xử lí mẫu vật
Thu phần rễ của cây có đất bám vào, còn tƣơi, đựng mẫu vào túi nilon có ghi rõ ngày lấy, nơi lấy mẫu, loại rễ cây, độ sâu của rễ.
Sau khi mang về phòng thí nghiệm rũ bỏ phần đất bám vào túi nilon vô trùng, phần đất rũ bỏ đƣợc dùng làm một mẫu phân lập.
Xử lí mẫu:
*Mẫu đất
- Phơi khô mẫu trong không khí, nghiền nhỏ trong cối xứ và rây để loại bỏ các phần hữu cơ và các hạt đất, đá, sỏi… có kích thƣớc lớn.
- Đất bột mịn đƣợc xử lí theo 1 trong 2 cách: (cách 1: gói trong giấy báo, sấy khô 100oC trong thời gian 45 phút; cách 2: hòa trong nƣớc muối sinh lí vô trùng, đun nóng tới 50o
25
- Sau khi xử lí, lấy 0,1ml mẫu đó tiến hành pha loãng tới 10-4 và chang trên đĩa môi trƣờng (lặp lại 3 lần / mẫu – mỗi mẫu phân lập tại 10-2
, 10-3, 10-4); 28 – 30oC trong 10-14 ngày.
*Mẫu rễ
- Rễ cây đƣợc rửa sạch, để ráo nƣớc trên bề bề mặt rễ (để trong tủ cấy có quạt hút cho khô (hoặc để trƣớc quạt bàn hoặc trong phòng có điều hòa).
Sau đó đƣợc xử lí nhƣ sau:
- Ngâm trong cồn 75% trong thời gian 5 phút.
- Rửa tiếp với NaClO (javen) 2%.
- Rửa tiếp bằng nƣớc cất vô trùng 5 lần cho sạch hết các hóa chất đã dùng ở các bƣớc trƣớc (cồn, javen).
- Dùng kéo thanh trùng, cắt rễ thành các đoạn ngắn 1cm. Cân 1 gam rễ cho vào cối xứ và nghiền nát (có bổ sung 45 ml nƣớc muối sinh lí vô trùng).
- Hút 0,1ml dịch sau nghiền chang đều trên môi trƣờng phân lập (sau khi đổ môi trƣờng vào đĩa petri, cần để cho bề mặt môi trƣờng khô hết nƣớc đọng).
- Nuôi cấy trong điều kiện 28 - 30oC trong thời gian 10 – 14 ngày.
2.4.2. Phân lập tuyển chon xạ khuẩn
Phần đất rũ bỏ từ rễ đƣợc dùng làm mẫu phân lập xạ khuẩn theo tỉ lệ 9ml nƣớc cất/1g đất. Pha loãng đến nồng độ 10-4
. Từ dung dịch pha loãng 10-2 – 10-4 nhỏ 0,1 ml sang đĩa petri chứa môi trƣờng Gause – I.
Dùng que chang vô trùng chang đều, sau đó nuôi ở nhiệt độ phòng 4 – 7 ngày, các khuẩn lạc đƣợc làm sạch cấy truyền sang ống thạch nghiêng chứa môi trƣờng Gause – I, tiếp tục nuôi ở 10 – 14 ngày.
2.4.3. Phương pháp bảo quản chủng giống
Các chủng xạ khuẩn đã lựa chọn đƣợc cấy trên môi trƣờng thạch nghiêng Gause - I ở nhiệt độ phòng. Sau 10-14 ngày khi xạ khuẩn mọc tốt,
26
các ống giống đƣợc bảo quản trong tủ lạnh ở 4 - 6oC. Sau 2 - 3 tháng cấy truyền lại một lần.
2.4.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
Quan sát màu sắc của hệ sợi khí sinh
Dựa theo tài liệu của ISP, Gause và cộng sự (1983), xác định màu sắc của HSKS dựa vào bảng màu của Tresner và Bakus. Căn cứ vào màu sắc HSKS của các chủng mới phân lập để phân thành các nhóm màu theo Gause và cộng sự: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh…
Quan sát màu sắc của hệ sợi cơ chất
Màu sắc của HSCC đƣợc xác định qua quan sát trực tiếp trên môi trƣờng thạch đĩa hoặc thạch nghiêng và mô tả theo thang màu chuẩn của Bondarsev (1953), Tresner và cộng sự (1961).
Quan sát cuống sinh bào tử
Phương pháp 1: Phương pháp xẻ rãnh khối thạch
Xạ khuẩn đƣợc rải đều trên bề mặt hộp petri chứa môi trƣờng Gause – I. Dùng dao vô trùng xẻ hai đƣờng song song ở giữa hộp lồng, bỏ khối thạch ở giữa hai đƣờng xẻ ra ngoài. Sau đó đặt lamen vô trùng chéo theo rãnh thạch vừa xẻ. Để hộp lồng nuôi cấy trong tủ ấm 3 – 5 ngày, lấy lamen ra quan sát phần xạ khuẩn mọc lan ra hai đƣờng xẻ trên kính hiển vi quang học.
Phương pháp 2: Găm lamen nghiêng 45o
Xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Gause - I có găm lamen nghiêng 45o trên bề mặt môi trƣờng. Sau 7 - 9 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng lấy ra quan sát hình dạng chuỗi sinh bào tử trên lamen dƣới kính hiển vi quang học. Chuỗi sinh bào tử có dạng thẳng hay lƣợn sóng ký hiệu là RF (Rectus Flexibilis), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Rectinaculum Apertum) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spira).
27
Sự hình thành sắc tố tan
Xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Gause – I. Sau 7, 14, 21 ngày lấy ra quan sát sắc tố tan tiết ra môi trƣờng.
2.4.5. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh a. Nguyên tắc
Nếu VSV trên khối thạch có khả năng hình thành CKS thì chúng sẽ ức chế và tiêu diệt các VSV kiểm định và tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh khối thạch.
b.Tiến hành thí nghiệm
Phương pháp đục lỗ (xác định hoạt tính kháng sinh trong dịch thể)
Chuẩn bị dịch kháng sinh: nuôi lắc xạ khuẩn trên môi trƣờng dịch thể từ 5 – 7 ngày. Li tâm dịch lên men 4000 vòng/phút, loại bỏ sinh khối lấy dịch để thử hoạt tính kháng sinh.
Chuẩn bị VSV kiểm định: nuôi lắc VSV kiểm định trên môi trƣờng dịch thể thích hợp cho mỗi loại VSV kiểm định (Vi khuẩn trên môi trƣờng MPA).
Thử hoạt tính:
- Dùng micropipette nhỏ 100µl VSV kiểm định lên bề mặt môi trƣờng thạch sau đó chang đều bằng que chang vô trùng.
- Dùng khoan nút chai vô trùng khoan đĩa thạch thành các lỗ có đƣờng kính 1cm.
- Dùng micropipette nhỏ 100µl dịch kháng sinh vào lỗ thạch. Để hộp petri vào tủ lạnh trong 8h, sau đó nuôi trong tủ ấm 24 – 48h.
- Đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng sinh: đo vòng vô khuẩn xung quanh lỗ thạch, hoạt tính kháng sinh đƣợc đánh giá bằng giá trị D – d .
Trong đó: D là đường kính vòng vô khuẩn (mm). d là đường kính lỗ thạch (mm).
(D-d) 25 mm: hoạt tính rất mạnh; (D-d) 20 mm: hoạt tính mạnh.
28
2.4.6. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả bằng toán học
Chúng tôi xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng pháp nhƣ:
Số trung bình cộng: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm: 1 1 n i i X X n
Trung bình bình phƣơng các sai lệch:
1 ) ( 1 2 n X X n i i
Sai số đại diện của trung bình cộng: m n
29
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.Phân lập xạ khuẩn từ vùng rễ cây rau dệukhu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc
Theo phƣơng pháp lấy mẫu nhƣ trên, vào các tháng 10, 12 năm 2013 và tháng 2 năm 2014, tôi đã thu thập đƣợc 3 mẫu cây rau dệu từ đất trồng với các độ sâu khác nhau tại 3 địa điểm khác nhau trong khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên , Vĩnh Phúc:
1. Ở đất trồng rau dệu vành đai Xuân Hòa với độ sâu 3cm. 2. Ở đất trồng rau dệu vƣờn Yên Mỹ với độ sâu 5cm. 3. Ở đất trồng rau dệu ruộng Yên Mỹ với độ sâu 7cm.
Sau khi thu mẫu, chúng tôi đã tiến hành phân lập các mẫu đất và mẫu rễ rau dệu trên môi trƣờng Gause - I tại phòng thí nghiệm vi sinh, khoa Sinh – KTNN trƣờng ĐHSPHN2. Căn cứ vào mật độ xạ khuẩn trong các mẫu đất và rễ, tôi chọn dịch đất có độ pha loãng 10-2 – 10-4 của các mẫu đất và rễ để phân lập.
Sau 5 – 7 ngày lấy ra quan sát những khuẩn lạc mọc đƣợc trên đĩa petri. Kết quả trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc từ vùng rễ cây rau dệu
Tháng Địa điểm Độ sâu Độ pha loãng Chủng XK
10 Vành đai 3 cm Đất 10-2 DD1, DD2, DD3, DD4 10-3 DD5, D6, DD7, DD8 10-4 DD9 Rễ DR1
30 12 Vƣờn Yên Mỹ 5 cm Đất 10-2 DD10, DD11, DD12 10-3 DD113, DD14 10-4 DD15, DD16 Rễ DR2 2 Ruộng Yên Mỹ 7 cm Đất 10-2 DD17, DD18, DD19 10-3 DD20, DD21 10-4 Rễ
Ghi chú: DD: Các chủng xạ khuẩn phân lập được từ đất DR: Các chủng xạ khuẩn phân lập được từ rễ cây rau dệu
Trên môi trƣờng Gause I cả xạ khuẩn, nấm mốc và một số vi khuẩn đều mọc. Nhƣng có thể phân biệt rõ ràng các khuẩn lạc này: Khuẩn lạc vi khuẩn thƣờng nhày, ƣớt nhẵn. Khuẩn lạc nấm mốc cũng có nhiều màu sắc nhƣ khuẩn lạc xạ khuẩn nhƣng khác ở chỗ nó phát triển nhanh và to hơn khuẩn lạc xạ khuẩn nhiều lần. Khuẩn lạc xạ khuẩn thì bông xốp, khô rắn chắc, xù xì, dạng da, dạng nhung, dạng phấn, nhìn kĩ có dạng sợi nấm nhƣng đƣờng kính sợi bé hơn sợi nấm rất nhiều chỉ bằng 1 đến 2 phần 10 đƣờng kính sợi nấm, nếu không có HSKS thì khuẩn lạc có dạng màng dẻo. Sau 3 ngày phát triển khuẩn lạc xạ khuẩn có kích thƣớc khoảng 0,5 – 2 mm.
31
Hình 3.1. Một số chủng xạ khuẩn phân lập được từ vùng rễ cây rau dệu
a. Mặt trên của các chủng xạ khuẩn DD8, DR1, DD1, DR2 phân lập được b. Mặt dưới của các chủng xạ khuẩn DD8, DR1, DD1, DR2 phân lập được c. Mặt trên của các chủng xạ khuẩn DD5, DD6, DD11, DD13 phân lập được d. Mặt dưới của các chủng xạ khuẩn DD5, DD6, DD11, DD13 phân lập được
Quan sát các mẫu phân lập sau 5 -7 ngày nuôi cấy thu được23 chủng xạ khuẩn khác nhau thuộc chi Streptomyces từ vùng rễ cây rau dệu của khu vực nghiên cứu. Trong đó có: 21 chủng thu được từ đất và 2 chủng từ rễ cây rau dệu. Điều đó cho thấy ở trong đất có số chủng xạ khuẩn nhiều hơn so với ở rễ cây rau dệu.
3.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc
Tiến hành nghiên cứu đặc điểm HSKS, HSCC… của các chủng xạ khuẩn đã phân lập đƣợc. Nuôi cấy các chủng này trên môi trƣờng Gause I, sau 5 – 7 ngày đem quan sát. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.2.
a b
32
Bảng 3.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc
STT Chủng xạ khuẩn Màu sắc khuẩn lạc
HSKS HSCC
1 DD1 Trắng Xanh Xanh đen
2 DD2 Vàng nhạt Vàng nâu 3 DD3 Nâu xám Trắng 4 DD4 Trắng Vàng 5 DD5 Hồng Nâu đen 6 DD6 Trắng Tím đen 7 DD7 Đỏ nâu Đỏ đen 8 DD8 Trắng Vàng 9 DD9 Trắng Vàng đậm 10 DD10 Trắng Vàng 11 DD11 Nâu Vàng 12 DD12 Hồng nhạt Nâu đen 13 DD13 Trắng Vàng nâu 14 DD14 Trắng Vàng nhạt 15 DD15 Trắng Trắng 16 DD16 Trắng Trắng 17 DD17 Trắng Vàng 18 DD18 Trắng Trắng 19 DD19 Trắng Trắng 20 DD20 Trắng Đen 21 DD21 Vàng nâu Vàng 22 DR1 Nâu xám Hồng nhạt 23 DR2 Trắng Hồng đậm
33
Khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập chủ yếu có dạng xù xì hoặc dạng bẹt, có kích thƣớc khá nhỏ so với khuẩn lạc của các loại vi sinh vật khác, khoảng 0,5 – 2 mm. Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn với hƣớng sinh trƣởng trong môi trƣờng tạo ra HSCC và mặt ngoài môi trƣờng tạo ra HSKS. Màu sắc của HSKS và HSCC rất đa dạng và phong phú: trắng, vàng, nâu, xám, hồng, xanh… và đây là một trong những đặc điểm để phân loại xạ khuẩn, nhờ vào đó ta có thể xác định xạ khuẩn đƣợc phân lập thuộc chi nào, họ nào, ngành nào…
DD5 DR2
Hình 3.2. Khuẩn lạc của một số chủng xạ khuẩn phân lập được
Qua kết quả phân lập xạ khuẩn dƣợc thống kê trong 2 bảng 3.1 và 3.2 có thể rút ra nhận xét sau:
Cả 3 loại đất vành đai, đất vƣờn, đất ruộng có số lƣợng xạ khuẩn trung bình trong 1g đất khô giảm dần theo chiều sâu lấy mẫu. Điều này hợp quy luật vì xạ khuẩn thuộc loại vi sinh vật hiếu khí nên ở các lớp đất trên thoáng khí hơn có số lƣợng xạ khuẩn nhiều.
Sau khi phân lập, chúng tôi đã thu thu đƣợc các khuẩn lạc xạ khuẩn riêng biệt trên các hộp petri, chọn những khuẩn lạc mọc tốt, không bi nhiễm cấy